• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    自噬基因融合蛋白重組多克隆抗體的純化與檢測(cè)

    2013-04-25 11:31:28朱雄偉張佑紅徐智鵬蘇騰甲翟莉莉
    關(guān)鍵詞:流液室溫孵育

    朱雄偉,張佑紅,徐智鵬,蘇騰甲,熊 瑤,翟莉莉

    (武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院,綠色化工過(guò)程省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430074)

    0 引 言

    免疫學(xué)技術(shù)正沿著基礎(chǔ)研究-應(yīng)用研究-高技術(shù)開(kāi)發(fā)研究3條主線(xiàn)在開(kāi)展,三者互相促進(jìn),推動(dòng)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展[1].雜交瘤技術(shù)的建立和細(xì)胞因子對(duì)免疫細(xì)胞發(fā)育、分化的發(fā)現(xiàn),基因工程技術(shù)的發(fā)展,使實(shí)驗(yàn)室的研究直接轉(zhuǎn)向生物高技術(shù)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā),如重組細(xì)胞因子、單克隆抗體及其相應(yīng)的試劑盒、多克隆抗體、基因工程抗體和疫苗等已經(jīng)或正在投入臨床使用,特別是抗體藥物以其對(duì)人體無(wú)毒無(wú)副作用、完全天然和高度特異性的療效,越來(lái)越顯示其優(yōu)勢(shì),并創(chuàng)造出巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益[2].

    1962年,Ashford等[3]報(bào)道在電子顯微鏡下發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞自噬現(xiàn)象,近年來(lái)由于發(fā)現(xiàn)與自噬相關(guān)的基因,以及自噬在生物體生理和病理等方面的作用,自噬基因融合蛋白(ATG12)是與自噬相關(guān)基因表達(dá)的蛋白.本研究合成帶谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)簽ATG12融合蛋白來(lái)免疫新西蘭大白兔,制備多克隆抗體,并用免疫親和純化方法提純抗血清中的多克隆抗體、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)抗體效價(jià)、蛋白印跡(Western blotting)檢測(cè)抗體特異性及在組織中的表達(dá)情況、聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)其濃度.

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 材 料

    1.1.1 研究對(duì)象 新西蘭大白兔.

    1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 抗原;乙醇;20 mmol/L 磷酸緩沖溶液p H 7.2;福氏佐劑;GST透析液;His溶液;PBS溶液;couping buffer;p H 5.0的甘氨酸;p H 2.0的 HCl溶液;1 mol/L Tris封閉液;p H 5.0 HCl溶液;CBB 溶液;0.01 mol/L Tris p H 7.5中和液;甘油;防腐劑Na N3;HRP酶標(biāo)二抗;質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%SKL;beads;0.01 mol/L PBS(p H 7.3);10% 分離膠;質(zhì)量分?jǐn)?shù)4% 濃縮膠;G250考馬斯亮藍(lán)溶液;0.15 mol/L NaCl溶液;2×(5×)SDS上樣緩沖液;甲醇;電泳緩沖液;轉(zhuǎn)移緩沖液;10×麗春紅染液、封閉液;TBST;TBS;ECL顯影底物;顯影液;定影液;DAB溶液;化學(xué)發(fā)光試劑、HRP酶標(biāo)二抗;脫脂奶粉;1 mol/L的Na HCO3;TMB顯色液;所有試劑均為分析級(jí).

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 抗血清的制備 具體方法如下[4]:

    a.新西蘭大白兔的免疫.免疫途徑有多種多樣,如靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、淋巴結(jié)內(nèi)注射等,一般常用皮下或背部多點(diǎn)皮內(nèi)注射,每點(diǎn)注射0.1 mL左右.抗原劑量,首次劑量為300~500μg,加強(qiáng)免疫的劑量約為首次劑量為1/4左右.每2~3周加強(qiáng)免疫一次.加強(qiáng)免疫時(shí)用不完全佐劑,首次免疫時(shí)皮下注射百日咳疫苗0.5 m L,加強(qiáng)免疫時(shí)不必注射百日咳疫苗.在第2次加強(qiáng)免疫后2周,從耳緣靜脈取2~3 m L血,制備血清,檢測(cè)抗體效價(jià).

    b.抗血清的采集與保存.取兔血有兩種方法,一是耳緣靜脈或耳動(dòng)脈放血,一是頸動(dòng)脈入血,也可心臟采血.取動(dòng)脈或靜脈放血時(shí),將兔放入一個(gè)特造的木匣或籠內(nèi),耳露于箱(籠)外,也可由另一人捉住兔身.剪去耳緣的毛,用少許二甲苯涂抹耳廓,30 s后,耳血管擴(kuò)張、充血.用手輕拉耳尖,以單面剃須刀或尖的手術(shù)刀片,快速切開(kāi)動(dòng)脈或靜脈,血液即流出,每次可收集30~40 m L.然后用棉球壓迫止血,凝血后洗去二甲苯.二星期后,可在另一耳放血.此法可反復(fù)多次放血.頸動(dòng)脈放血時(shí),將兔仰臥,固定于兔臺(tái),剪去頸部的毛,切開(kāi)皮膚,暴露頸動(dòng)脈,插管,放血.取收集的血液在37℃恒溫箱中放置30 min以防止激活補(bǔ)體系統(tǒng),再將試管在4℃放置過(guò)夜使血液凝固.用藥鏟將血凝塊從管壁上撥落,將血液轉(zhuǎn)移至塑料離心管中,于4℃下4 000 r/min離心10 min.在無(wú)菌條件,吸出血清,分裝,可在-20℃保存數(shù)年.

    1.2.2 抗體的純化 具體步驟如下[5]:

    a.抗原柱子的制備.找到相應(yīng)的血清和抗原、抗原的透析(對(duì)非包涵體蛋白)、活化beads、抗原與beads連接、封閉beads.

    b.抗血清的預(yù)處理.將解凍好的血清在3 600 r/min,條件下離心17 min;除去離心后浮在表面的脂肪,將血清轉(zhuǎn)移到標(biāo)記好的瓶子中備用,注意盡量不要將沉在管底的血細(xì)胞倒出;對(duì)免疫原是GST融合蛋白的血清,同時(shí)是純化抗原也是GST融合蛋白,此時(shí)需過(guò)GST柱子,吸附掉anti-GST的抗體.注意此時(shí)要留抗原小樣,做ELISA檢測(cè)看anti-GST的抗體有沒(méi)有除盡.

    c.beads與對(duì)應(yīng)的抗血清的結(jié)合.將連接好抗原的beads和對(duì)應(yīng)的抗血清一起孵育,封口后排氣,在轉(zhuǎn)子上固定好,孵育,室溫2 h或4℃過(guò)夜,讓血清流出純化管,收集,10 m L PBS洗滌三次.

    d.收集抗體.加入10 mL p H5.0甘氨酸,預(yù)洗脫,加入預(yù)冷的HCl洗脫液.同時(shí)檢測(cè)收集的抗體濃度,確定收集峰,收集濃度高抗體,于4℃暫時(shí)保存.

    e.濃縮和透析.將濃度不高的抗體吸水濃縮,注意放4℃保持低溫.濃縮好后透析.次日檢測(cè)收集的抗體濃度,確定收集峰.收集濃度高抗體,于4℃暫時(shí)保存.

    f.beads的清洗和保存.依次用Tris和PBS洗,加入甘油、防腐劑-20℃保存.

    1.2.3 ELISA 檢測(cè)[6-8]a.抗原包被.用抗原包被液(1 mol/L的 Na HCO3)稀釋抗原,50微升/孔,蛋白量為2~3μg/m L,孵育,室溫2 h或4℃過(guò)夜,用GST標(biāo)簽蛋白作對(duì)照.

    b.封閉.倒出孔內(nèi)溶液,拍干,每孔加入100 u L稀釋液 (3% 脫脂牛奶+PBST),封閉,放搖床上室溫孵育1 h.

    c.加一抗.倒出孔內(nèi)溶液,拍干,洗3次,每次5 min.倒出孔內(nèi)溶液,拍干,加入一抗,搖床上室溫孵育1 h.

    d.加二抗.倒出孔內(nèi)溶液,拍干,洗三次,每次5 min.倒出孔內(nèi)溶液,拍干,加入二抗,搖床上室溫孵育1 h.

    e.加底物顯色.TMB顯色液A、B按1∶1混合,100μL/孔,放搖床上15 min內(nèi)觀(guān)察結(jié)果,照相.

    f.SDS-PAGE電泳.電泳時(shí)間一般4~5 h,電壓為40 V較好,也可用60 V.電泳至溴酚藍(lán)剛跑出即可終止電泳,進(jìn)行轉(zhuǎn)膜.

    g.轉(zhuǎn) 膜.

    (1)轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備6張7.0~8.3 cm 的濾紙和1張7.3~8.6 cm的PVDF膜,將切好的PVDF膜置于甲醇上浸才可使用.

    (2)在加有轉(zhuǎn)移液的塑料盒里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和浸過(guò)的膜.

    (3)將夾子打開(kāi)使黑的一面保持水平.在上面墊一張海綿墊,用玻棒來(lái)回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡.

    (4)要先將玻璃板撬掉才可剝膠,撬的時(shí)候動(dòng)作要輕,要在兩個(gè)邊上輕輕的反復(fù)撬.撬一會(huì)兒玻璃板便開(kāi)始松動(dòng),直到撬去玻璃板.小心剝下分離膠蓋于濾紙上,用手調(diào)整使其與濾紙對(duì)齊,輕輕用玻棒搟去氣泡.在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡.最后蓋上另一個(gè)海綿墊,搟幾下就可合起夾子.整個(gè)操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行,要不斷的搟去氣泡,膜兩邊的濾紙不能相互接觸,接觸后會(huì)發(fā)生短路.

    (5)將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中,要使夾的黑面對(duì)槽的黑面,夾的白面對(duì)槽的紅面.電轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn)熱,在槽的一邊放一塊冰來(lái)降溫.一般用60 V轉(zhuǎn)移2 h或40 V轉(zhuǎn)移3 h.(6)轉(zhuǎn)完后將膜用1×麗春紅染液染5 min,然后用水沖洗掉沒(méi)染上的染液就可看到膜上的蛋白.將膜晾干備用.

    h.免疫反應(yīng).

    (1)將膜用TBS從下向上浸濕后,移至含有封閉液的平皿中,室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉1 h.

    (2)將一抗用TBST稀釋至適當(dāng)濃度,撕下適當(dāng)大小的一塊兒保鮮膜鋪于實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上,四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整;將抗體溶液加到保鮮膜上;從封閉液中取出膜,用濾紙吸去殘留液后,將膜蛋白面朝下放于抗體液面上,室溫下孵育1~2 h后,用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次,再用TBS洗一次.

    (3)準(zhǔn)備二抗稀釋液并與膜接觸,室溫下孵育1~2 h后,用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次,每次10 min;再用TBST洗一次,10 min,進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng).

    i.化學(xué)發(fā)光、顯影、定影[9-10].

    (1)將A和B兩種試劑在保鮮膜上等體積混合,1 min后,將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸,1 min后,將膜移至另一保鮮膜上,去盡殘液,包好,放入暗盒中.

    (2)在暗室中,將1×顯影液和定影液分別到入塑料盤(pán)中;在紅燈下取出膠片,用切紙刀剪裁適當(dāng)大??;打開(kāi)暗盒,把膠片放在膜上,一旦放上,便不能移動(dòng),關(guān)上暗盒,開(kāi)始計(jì)時(shí);根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間,一般為1 min或5 min,也可選擇不同時(shí)間多次壓片,以達(dá)最佳效果;曝光完成后,打開(kāi)暗盒,取出膠片,迅速浸入顯影液中顯影,待出現(xiàn)明顯條帶后,即刻終止顯影.顯影時(shí)間一般為1~2 min(20~25℃),顯影結(jié)束后,馬上把膠片浸入定影液中,定影時(shí)間一般為5~10 min,以膠片透明為止,用自來(lái)水沖去殘留的定影液后,室溫下晾干.

    2 結(jié)果與討論

    2.1 GST柱子分析

    免疫原是GST融合蛋白的血清,同時(shí)是純化GST柱子的穿流夜Ft GST融合蛋白,此時(shí)需過(guò)GST柱子,用來(lái)吸附掉anti-GST的抗體.圖1所示的是未過(guò)GST柱子的血清F和GST柱子的穿流液Ft加入TMB底物后顯色反應(yīng),表1所示的是血清F與穿流液Ft的稀釋梯度[11-12].

    表1 血清F與穿流液Ft的稀釋梯度Table 1 Dilution gradient of serum F and transit fluid Ft

    圖1 血清F(“1”)與穿流液Ft(“2”)的顯色反應(yīng)Fig.1 Chromogenic reaction of serum F and transit fluid

    由圖1和表1可知:在四種梯度下,血清F加TMB底物顯色后四孔全部顯藍(lán)色,而穿流液Ft全部無(wú)色,說(shuō)明anti-GST已除干凈.

    2.2 ELISA結(jié)果分析

    圖2所示的是未過(guò)GST柱子的血清F、GST柱子的穿流液Ft和抗體Pu加入TMB底物后顯色反應(yīng)、表2所示的是血清F、穿流液Ft和抗體Pu的稀釋梯度.

    圖2 血清F、穿流液Ft、抗體Pu的顯色反應(yīng)Fig.2 Chromogenic reaction of serum F,transit fluid Ft and antibody Pu

    由圖2和表2可知,以Ft為參照,F(xiàn)、Ft、Pu顯色孔數(shù)依次為4,3,4,其中Ft的是底色.結(jié)果說(shuō)明血清還可以進(jìn)一步純化,而且收集的純化血清效果也不錯(cuò),即稀釋度為1:500 000.

    表2 血清F、穿流液Ft、抗體Pu的稀釋梯度Table 2 Dilution gradient of serum F,transit fluid Ft and antibody Pu

    2.3 SDS-PAGE測(cè)定 ATG 12多克隆抗體濃度[13]

    使用SDS-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,圖3所示的是ATG12多克隆抗體的SDS-PAGE圖.如圖3所示:左邊的條帶為ATG12蛋白,右邊為marker條帶,marker的分子質(zhì)量圖中已經(jīng)標(biāo)出.以67 k D為參照來(lái)估測(cè)蛋白濃度,67 k D代表的marker質(zhì)量濃度為每10μL含8μg,而目的蛋白的顏色只有其5/8深,則蛋白濃度為每10μL 5/8×8μg,即每10μL為5μg.

    圖3 ATG12多克隆抗體的SDS-PAGEFig.3 SDS-PAGE of ATG12 polyclonal antibody

    圖4 免疫印記蛋白質(zhì)大小Fig.4 Size of Immune mark protein

    2.4 Western blotting分析

    圖4所示的是免疫印記蛋白質(zhì)大小及在Colon(結(jié)腸)中的表達(dá)條帶中的表達(dá)情況.

    由圖4可知:Western blotting條帶上的點(diǎn)清晰,說(shuō)明其能在結(jié)腸中較好的表達(dá),由圖知蛋白質(zhì)大小為55 k D左右.

    3 結(jié) 語(yǔ)

    使用帶GST標(biāo)簽的融合蛋白免疫新西蘭大白兔,制備得到ATG12多克隆抗體,運(yùn)用ELISA及Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示此抗體效價(jià)及特異性較高,Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示其在結(jié)腸組織中表達(dá),SDS-PAGE結(jié)果顯示其濃度也較高.本研究成功得到濃度較高的ATG12多克隆抗體,并證實(shí)其在結(jié)腸組織中表達(dá)較明顯.

    致謝

    感謝天惠生物公司對(duì)本研究的支持與幫助.

    [1]周建光,楊梅.免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展及臨床應(yīng)用[J].醫(yī)療裝備,2011,24(7):49-51.

    [2]孔維,楊文輝.單克隆抗休及其應(yīng)用的研究進(jìn)展[J]畜牧獸醫(yī)科技信息,2009(1):9-11.

    [3]Ashford T P,Porter K R.Cytoplasmic components in hepatic cell lysosomes[J].The Journal of cell biology,1962(1):198-202.

    [4]譚榮榮,劉明炎,龔自明.茶尺蠖核型多角體病毒多克隆抗體的制備及檢測(cè)應(yīng)用[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,51(2):298-301.

    [5]張花美,李因來(lái),潘熙萍.抗麥草畏多克隆抗體v的制備及其間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的建立[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào):農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版,2012,38(2):153-158.

    [6]Susumu H T,Suzuki K,Akahori Y.Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity is induced by a single-chain Fv-protein III fusion in the presence of a rabbit anti-protein III polyclonalantibody[J].Immunology Letters,2011,136(1):44-48.

    [7]Horiguchi T,Urushitani H,Ohta Y.Establishment of a polyclonal antibody against the retinoid X receptor of the rock shell Thais clavigera and its application to rock shell tissues for imposex research[J].Ecotoxicology,2010,19(3):571-576.

    [8]Xu M Y,Wang S D.Prokaryotic expression of pathogenesis related protein 1 gene from Nicotiana benthamiana:antifungal activity and preparation of its polyclonal antibody[J].Biotechnology Letters,2012,34(5):919-924.

    [9]Anderson G J,Cipolla C M,Kennedy R T.Western Blotting Using Capillary Electrophoresis[J].Analytical chemistry,2011,83(4):1350-1355.

    [10]Welinder C,Ekblad L.Coomassie Staining as Loading Control in Western Blot Analysis[J].Journal of proteome research,2011,10(3):1416-1419.

    [11]Rath A,Glibowicka M,Nadeau V G.Detergent binding explains anomalous SDS-PAGE migration of membrane proteins[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2009,106(6):1760-1765.

    [12]Hans J C,Wessels R O.LC-MS/MS as an alternative for SDS-PAGE in blue native analysis of protein complexes[J].Cell & Molecular Biology,2009,9(17):4221-4228.

    [13]Riechers A,Schmidt F,Stadlbauer S.Detection of Protein Phosphorylation on SDS-PAGE Using Probes with a Phosphate-Sensitive Emission Response[J].Bioconjugate Chemistry,2009,20(4):804-807.

    猜你喜歡
    流液室溫孵育
    超導(dǎo)追求
    室溫采集裝置及供熱二級(jí)管網(wǎng)智能化改造
    煤氣與熱力(2021年2期)2021-03-19 08:55:50
    光學(xué)玻璃電熔窯流液洞的數(shù)值模擬分析
    母豬子宮內(nèi)膜炎和產(chǎn)道惡露綜合征診治
    三物黃芩湯組分(群)配伍在大鼠肝微粒體孵育模型中的相互作用
    中成藥(2017年9期)2017-12-19 13:34:27
    Identifying vital edges in Chinese air route network via memetic algorithm
    大鼠肝微粒體孵育體系中2種成分的測(cè)定及其代謝
    中成藥(2017年5期)2017-06-13 13:01:12
    羅布麻莖傷流液成分研究
    一種在室溫合成具有寬帶隙CdS的簡(jiǎn)單方法
    甲氧基MQ樹(shù)脂補(bǔ)強(qiáng)縮合型室溫硫化硅橡膠的研究
    99热这里只有是精品在线观看| 三级毛片av免费| 观看美女的网站| 国产亚洲91精品色在线| 精品人妻视频免费看| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 美女免费视频网站| 一a级毛片在线观看| 色哟哟哟哟哟哟| 伦理电影大哥的女人| 成人永久免费在线观看视频| 国产在线男女| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 久久久久久久久久成人| 少妇高潮的动态图| 一区二区三区激情视频| 又粗又爽又猛毛片免费看| 欧美日本亚洲视频在线播放| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 精品久久久久久久久av| 99九九线精品视频在线观看视频| 校园人妻丝袜中文字幕| 中亚洲国语对白在线视频| 国产精华一区二区三区| 久9热在线精品视频| 一级黄片播放器| 成年女人毛片免费观看观看9| 成人亚洲精品av一区二区| 精品久久久噜噜| 色综合婷婷激情| 亚洲精品在线观看二区| or卡值多少钱| 免费大片18禁| 成人无遮挡网站| 一进一出抽搐动态| 老司机午夜福利在线观看视频| 亚洲不卡免费看| 免费观看精品视频网站| 亚洲,欧美,日韩| 国产乱人伦免费视频| 三级国产精品欧美在线观看| 免费看a级黄色片| 精品国产三级普通话版| 99在线人妻在线中文字幕| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 欧美在线一区亚洲| 亚洲成人久久爱视频| 最新在线观看一区二区三区| 99久久成人亚洲精品观看| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 全区人妻精品视频| 色在线成人网| 亚洲av免费在线观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 中国美女看黄片| 一进一出抽搐动态| 久久精品国产亚洲av天美| 黄色欧美视频在线观看| 欧美人与善性xxx| 婷婷精品国产亚洲av| 中文字幕av成人在线电影| 在线观看一区二区三区| 国产一区二区激情短视频| 99国产精品一区二区蜜桃av| 午夜爱爱视频在线播放| 啪啪无遮挡十八禁网站| 1024手机看黄色片| 两人在一起打扑克的视频| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 少妇的逼水好多| 成人国产综合亚洲| 日本黄大片高清| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲av成人av| 日本a在线网址| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲一区高清亚洲精品| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 中文资源天堂在线| 国产精品98久久久久久宅男小说| 欧美一区二区精品小视频在线| www日本黄色视频网| 99热只有精品国产| 亚洲七黄色美女视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 91麻豆av在线| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 1000部很黄的大片| 精品久久久久久久久亚洲 | 可以在线观看的亚洲视频| 老司机福利观看| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产乱人伦免费视频| 一区二区三区高清视频在线| 久久人人精品亚洲av| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 欧美性猛交黑人性爽| 国产成人影院久久av| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 一级av片app| 国产色婷婷99| 看免费成人av毛片| 两个人的视频大全免费| 国产一区二区在线观看日韩| 国产高清视频在线观看网站| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲国产色片| 在线播放国产精品三级| 婷婷精品国产亚洲av| 欧美+亚洲+日韩+国产| 少妇丰满av| 九色成人免费人妻av| 狠狠狠狠99中文字幕| 精品无人区乱码1区二区| 老女人水多毛片| 91在线观看av| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 国产三级在线视频| 88av欧美| 嫩草影院新地址| 国产亚洲av嫩草精品影院| 欧美中文日本在线观看视频| 日韩大尺度精品在线看网址| 麻豆成人av在线观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 长腿黑丝高跟| 最近中文字幕高清免费大全6 | 联通29元200g的流量卡| 久久香蕉精品热| 精品人妻视频免费看| 国产国拍精品亚洲av在线观看| а√天堂www在线а√下载| 乱系列少妇在线播放| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 韩国av一区二区三区四区| 国产熟女欧美一区二区| 美女免费视频网站| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 亚洲黑人精品在线| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 久久精品国产亚洲av天美| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 女同久久另类99精品国产91| 91av网一区二区| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| av女优亚洲男人天堂| 99热这里只有精品一区| 亚洲性久久影院| 欧美日韩黄片免| 日本 av在线| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产日本99.免费观看| 乱码一卡2卡4卡精品| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 黄片wwwwww| a级毛片a级免费在线| 在现免费观看毛片| 欧美高清性xxxxhd video| 搞女人的毛片| 搡老岳熟女国产| 免费观看人在逋| 国产人妻一区二区三区在| 日本三级黄在线观看| 伦精品一区二区三区| 国产一区二区三区视频了| 国产私拍福利视频在线观看| 日本爱情动作片www.在线观看 | 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产精品乱码一区二三区的特点| 亚洲精品一区av在线观看| 久久久久久久午夜电影| 亚洲最大成人手机在线| 欧美高清性xxxxhd video| 成人国产综合亚洲| 亚洲精品成人久久久久久| 成人特级av手机在线观看| 嫁个100分男人电影在线观看| 内地一区二区视频在线| 成人永久免费在线观看视频| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 欧美最黄视频在线播放免费| 国产黄片美女视频| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产精品一及| 制服丝袜大香蕉在线| 精品一区二区三区视频在线| 别揉我奶头 嗯啊视频| 国内精品一区二区在线观看| 午夜福利高清视频| 丰满的人妻完整版| 偷拍熟女少妇极品色| 国内精品宾馆在线| 校园春色视频在线观看| 日韩在线高清观看一区二区三区 | 2021天堂中文幕一二区在线观| 精品久久国产蜜桃| 在现免费观看毛片| 午夜久久久久精精品| 黄色一级大片看看| 精品人妻1区二区| 麻豆国产97在线/欧美| 色精品久久人妻99蜜桃| 极品教师在线视频| 不卡视频在线观看欧美| 国产三级在线视频| 亚洲精品国产成人久久av| 精品一区二区三区视频在线| 亚洲三级黄色毛片| 中文亚洲av片在线观看爽| 精品人妻视频免费看| 亚洲av成人av| 春色校园在线视频观看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产 一区 欧美 日韩| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲美女黄片视频| 亚洲熟妇熟女久久| 精品久久久久久久末码| 欧美极品一区二区三区四区| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 丝袜美腿在线中文| 99久国产av精品| 在线国产一区二区在线| 精品人妻偷拍中文字幕| 久久国产乱子免费精品| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 毛片女人毛片| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 成年版毛片免费区| 亚洲精品成人久久久久久| 91在线精品国自产拍蜜月| 成年女人毛片免费观看观看9| 91在线观看av| 此物有八面人人有两片| 天堂√8在线中文| 嫩草影院入口| 色av中文字幕| 91狼人影院| 欧美又色又爽又黄视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| 成人性生交大片免费视频hd| 国产精品人妻久久久久久| 男女啪啪激烈高潮av片| 日韩欧美免费精品| 女的被弄到高潮叫床怎么办 | 日本a在线网址| 亚洲男人的天堂狠狠| 永久网站在线| 国国产精品蜜臀av免费| 最新在线观看一区二区三区| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产三级在线视频| 嫩草影院新地址| 别揉我奶头 嗯啊视频| 白带黄色成豆腐渣| 色综合亚洲欧美另类图片| 久久久久国内视频| 国产激情偷乱视频一区二区| 波多野结衣高清无吗| 免费观看人在逋| 国产久久久一区二区三区| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| 美女高潮的动态| av在线天堂中文字幕| 欧美色欧美亚洲另类二区| 中国美白少妇内射xxxbb| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲av熟女| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 中文亚洲av片在线观看爽| 有码 亚洲区| 夜夜夜夜夜久久久久| 婷婷亚洲欧美| 亚洲熟妇熟女久久| 麻豆av噜噜一区二区三区| 看十八女毛片水多多多| 欧美黑人欧美精品刺激| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 亚洲欧美日韩高清专用| 人人妻人人看人人澡| 久久国产乱子免费精品| 亚洲国产精品成人综合色| 九色国产91popny在线| av.在线天堂| 久久久久久国产a免费观看| 成年女人毛片免费观看观看9| 小说图片视频综合网站| 嫩草影院精品99| 国产视频内射| 亚洲av二区三区四区| 一进一出好大好爽视频| 久久久色成人| 老司机深夜福利视频在线观看| 日本 av在线| 亚洲欧美日韩高清专用| 欧美人与善性xxx| 国产精品免费一区二区三区在线| 国产日本99.免费观看| 婷婷亚洲欧美| 九色成人免费人妻av| 欧美3d第一页| 亚洲成人免费电影在线观看| 99在线人妻在线中文字幕| 亚洲一区高清亚洲精品| av.在线天堂| 黄色视频,在线免费观看| 国产久久久一区二区三区| 大型黄色视频在线免费观看| 免费搜索国产男女视频| 欧美潮喷喷水| 美女免费视频网站| 毛片女人毛片| 91在线观看av| 99热只有精品国产| 免费看日本二区| 亚洲中文字幕日韩| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 中文字幕免费在线视频6| 日本-黄色视频高清免费观看| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 在线播放国产精品三级| 国产乱人视频| 夜夜爽天天搞| 国产伦精品一区二区三区四那| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 俺也久久电影网| 中文字幕高清在线视频| 少妇丰满av| 在现免费观看毛片| 一个人看视频在线观看www免费| www.色视频.com| 日本-黄色视频高清免费观看| 黄色视频,在线免费观看| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 日韩av在线免费看完整版不卡| 在线观看免费高清a一片| 免费看不卡的av| 我的女老师完整版在线观看| 久久99热6这里只有精品| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产精品爽爽va在线观看网站| 最近最新中文字幕大全电影3| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 卡戴珊不雅视频在线播放| 日韩欧美一区视频在线观看 | 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲精品第二区| 欧美最新免费一区二区三区| 免费av中文字幕在线| 久久久a久久爽久久v久久| 国产真实伦视频高清在线观看| 99久国产av精品国产电影| 日本黄色日本黄色录像| 各种免费的搞黄视频| 免费黄色在线免费观看| 成人亚洲精品一区在线观看 | 99热这里只有是精品在线观看| 黄色日韩在线| 国产视频首页在线观看| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 毛片一级片免费看久久久久| 97超视频在线观看视频| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲av日韩在线播放| 国精品久久久久久国模美| 日韩电影二区| 精品国产三级普通话版| 久久久久精品性色| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 久久久久久久久久久丰满| 国产永久视频网站| 午夜福利影视在线免费观看| 久久女婷五月综合色啪小说| 欧美一区二区亚洲| 国产色婷婷99| 精品久久久久久电影网| 亚洲精品成人av观看孕妇| 你懂的网址亚洲精品在线观看| av在线播放精品| 亚洲三级黄色毛片| 高清日韩中文字幕在线| 亚洲精品456在线播放app| 日本-黄色视频高清免费观看| 超碰av人人做人人爽久久| 亚洲三级黄色毛片| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产黄色视频一区二区在线观看| 在线天堂最新版资源| 国产黄片视频在线免费观看| 成人午夜精彩视频在线观看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产精品伦人一区二区| 国产免费一级a男人的天堂| 91久久精品国产一区二区成人| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲美女视频黄频| 51国产日韩欧美| 我的老师免费观看完整版| 男女国产视频网站| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲美女黄色视频免费看| 成人无遮挡网站| www.av在线官网国产| 嫩草影院新地址| 91狼人影院| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 免费黄频网站在线观看国产| 国产精品无大码| 亚洲人与动物交配视频| 久久人妻熟女aⅴ| 高清不卡的av网站| 欧美高清成人免费视频www| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| av线在线观看网站| 亚洲欧美日韩无卡精品| 久久久久精品性色| 人体艺术视频欧美日本| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 午夜免费观看性视频| 一级毛片 在线播放| 亚洲国产成人一精品久久久| 在线观看免费日韩欧美大片 | 视频区图区小说| 久久久久网色| 一个人看的www免费观看视频| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 美女中出高潮动态图| www.色视频.com| 99热这里只有精品一区| 街头女战士在线观看网站| 女性被躁到高潮视频| 黑丝袜美女国产一区| 免费观看性生交大片5| 欧美+日韩+精品| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| h视频一区二区三区| 激情五月婷婷亚洲| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲精品视频女| 一级av片app| 国产伦精品一区二区三区视频9| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 久久人人爽人人爽人人片va| 亚洲性久久影院| 男男h啪啪无遮挡| 日本-黄色视频高清免费观看| 51国产日韩欧美| 欧美日韩视频精品一区| 新久久久久国产一级毛片| 国产男女内射视频| 国产伦在线观看视频一区| 男男h啪啪无遮挡| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 2021少妇久久久久久久久久久| 国产乱人视频| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 久久久久人妻精品一区果冻| 伊人久久精品亚洲午夜| 日本一二三区视频观看| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 日韩大片免费观看网站| 蜜桃在线观看..| 免费观看性生交大片5| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国产老妇伦熟女老妇高清| 婷婷色麻豆天堂久久| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 婷婷色综合大香蕉| 一个人免费看片子| av一本久久久久| 亚洲欧美日韩东京热| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 欧美成人精品欧美一级黄| 99久久中文字幕三级久久日本| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 久久久久久久精品精品| 高清午夜精品一区二区三区| 少妇熟女欧美另类| 又大又黄又爽视频免费| 一级毛片aaaaaa免费看小| 校园人妻丝袜中文字幕| 免费观看在线日韩| 国产精品一二三区在线看| 草草在线视频免费看| 夜夜爽夜夜爽视频| 色视频在线一区二区三区| 国产av精品麻豆| 午夜激情福利司机影院| 少妇人妻一区二区三区视频| 性色av一级| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 日韩一本色道免费dvd| 老司机影院成人| 欧美日韩综合久久久久久| 日日摸夜夜添夜夜爱| 蜜桃在线观看..| 日韩强制内射视频| kizo精华| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产成人午夜福利电影在线观看| 国产亚洲最大av| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 在线观看国产h片| 日韩成人伦理影院| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 视频中文字幕在线观看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 18禁在线播放成人免费| 人妻一区二区av| 黄色怎么调成土黄色| 国产欧美亚洲国产| 在线观看免费高清a一片| 久久女婷五月综合色啪小说| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产精品久久久久久久电影| 我要看黄色一级片免费的| 制服丝袜香蕉在线| 精品一区二区三区视频在线| 亚洲精品aⅴ在线观看| 国产片特级美女逼逼视频| 国产精品一区二区性色av| 国产淫片久久久久久久久| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 亚洲国产精品成人久久小说| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 国产伦精品一区二区三区视频9| 日韩欧美一区视频在线观看 | 国产乱人偷精品视频| 国产亚洲最大av| .国产精品久久| 99热全是精品| 丰满人妻一区二区三区视频av| 亚洲精品一二三| 国产精品久久久久久av不卡| 国产黄色免费在线视频| 涩涩av久久男人的天堂| 免费大片18禁| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲精品国产av蜜桃| 高清av免费在线| 色综合色国产| 狂野欧美激情性bbbbbb| 少妇人妻久久综合中文| 人妻一区二区av| 一本一本综合久久| 26uuu在线亚洲综合色| 国产伦精品一区二区三区四那| 99久久综合免费| 这个男人来自地球电影免费观看 | 国产人妻一区二区三区在| 久久99精品国语久久久| 特大巨黑吊av在线直播| 哪个播放器可以免费观看大片| 亚洲av综合色区一区| 哪个播放器可以免费观看大片| 国产精品蜜桃在线观看| 亚洲国产av新网站| 国产一区有黄有色的免费视频| 成人影院久久| 欧美三级亚洲精品| 极品教师在线视频| 欧美国产精品一级二级三级 | 国产精品一及| 国产成人freesex在线| 老司机影院成人| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 18+在线观看网站| 亚洲综合精品二区| 国产一区二区三区av在线| 在线观看一区二区三区激情| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国产免费福利视频在线观看| 少妇 在线观看| 黄片wwwwww| 国产高清三级在线| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 久久久欧美国产精品| 日韩成人av中文字幕在线观看| 欧美区成人在线视频| 亚洲精品中文字幕在线视频 | av在线播放精品| 日韩av在线免费看完整版不卡| 乱码一卡2卡4卡精品| 日本爱情动作片www.在线观看| 日韩人妻高清精品专区| 在线观看人妻少妇| 久久97久久精品| 这个男人来自地球电影免费观看 | 97在线人人人人妻| 午夜免费鲁丝| 国产高潮美女av| av在线app专区| 日本爱情动作片www.在线观看| 中文字幕av成人在线电影| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 久久青草综合色| 婷婷色麻豆天堂久久| 日本欧美视频一区| 大片免费播放器 马上看| 国产精品无大码| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 我要看黄色一级片免费的|