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    自噬基因融合蛋白重組多克隆抗體的純化與檢測(cè)

    2013-04-25 11:31:28朱雄偉張佑紅徐智鵬蘇騰甲翟莉莉
    關(guān)鍵詞:流液室溫孵育

    朱雄偉,張佑紅,徐智鵬,蘇騰甲,熊 瑤,翟莉莉

    (武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院,綠色化工過(guò)程省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430074)

    0 引 言

    免疫學(xué)技術(shù)正沿著基礎(chǔ)研究-應(yīng)用研究-高技術(shù)開(kāi)發(fā)研究3條主線(xiàn)在開(kāi)展,三者互相促進(jìn),推動(dòng)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展[1].雜交瘤技術(shù)的建立和細(xì)胞因子對(duì)免疫細(xì)胞發(fā)育、分化的發(fā)現(xiàn),基因工程技術(shù)的發(fā)展,使實(shí)驗(yàn)室的研究直接轉(zhuǎn)向生物高技術(shù)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā),如重組細(xì)胞因子、單克隆抗體及其相應(yīng)的試劑盒、多克隆抗體、基因工程抗體和疫苗等已經(jīng)或正在投入臨床使用,特別是抗體藥物以其對(duì)人體無(wú)毒無(wú)副作用、完全天然和高度特異性的療效,越來(lái)越顯示其優(yōu)勢(shì),并創(chuàng)造出巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益[2].

    1962年,Ashford等[3]報(bào)道在電子顯微鏡下發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞自噬現(xiàn)象,近年來(lái)由于發(fā)現(xiàn)與自噬相關(guān)的基因,以及自噬在生物體生理和病理等方面的作用,自噬基因融合蛋白(ATG12)是與自噬相關(guān)基因表達(dá)的蛋白.本研究合成帶谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)簽ATG12融合蛋白來(lái)免疫新西蘭大白兔,制備多克隆抗體,并用免疫親和純化方法提純抗血清中的多克隆抗體、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)抗體效價(jià)、蛋白印跡(Western blotting)檢測(cè)抗體特異性及在組織中的表達(dá)情況、聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)其濃度.

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 材 料

    1.1.1 研究對(duì)象 新西蘭大白兔.

    1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 抗原;乙醇;20 mmol/L 磷酸緩沖溶液p H 7.2;福氏佐劑;GST透析液;His溶液;PBS溶液;couping buffer;p H 5.0的甘氨酸;p H 2.0的 HCl溶液;1 mol/L Tris封閉液;p H 5.0 HCl溶液;CBB 溶液;0.01 mol/L Tris p H 7.5中和液;甘油;防腐劑Na N3;HRP酶標(biāo)二抗;質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%SKL;beads;0.01 mol/L PBS(p H 7.3);10% 分離膠;質(zhì)量分?jǐn)?shù)4% 濃縮膠;G250考馬斯亮藍(lán)溶液;0.15 mol/L NaCl溶液;2×(5×)SDS上樣緩沖液;甲醇;電泳緩沖液;轉(zhuǎn)移緩沖液;10×麗春紅染液、封閉液;TBST;TBS;ECL顯影底物;顯影液;定影液;DAB溶液;化學(xué)發(fā)光試劑、HRP酶標(biāo)二抗;脫脂奶粉;1 mol/L的Na HCO3;TMB顯色液;所有試劑均為分析級(jí).

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 抗血清的制備 具體方法如下[4]:

    a.新西蘭大白兔的免疫.免疫途徑有多種多樣,如靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、淋巴結(jié)內(nèi)注射等,一般常用皮下或背部多點(diǎn)皮內(nèi)注射,每點(diǎn)注射0.1 mL左右.抗原劑量,首次劑量為300~500μg,加強(qiáng)免疫的劑量約為首次劑量為1/4左右.每2~3周加強(qiáng)免疫一次.加強(qiáng)免疫時(shí)用不完全佐劑,首次免疫時(shí)皮下注射百日咳疫苗0.5 m L,加強(qiáng)免疫時(shí)不必注射百日咳疫苗.在第2次加強(qiáng)免疫后2周,從耳緣靜脈取2~3 m L血,制備血清,檢測(cè)抗體效價(jià).

    b.抗血清的采集與保存.取兔血有兩種方法,一是耳緣靜脈或耳動(dòng)脈放血,一是頸動(dòng)脈入血,也可心臟采血.取動(dòng)脈或靜脈放血時(shí),將兔放入一個(gè)特造的木匣或籠內(nèi),耳露于箱(籠)外,也可由另一人捉住兔身.剪去耳緣的毛,用少許二甲苯涂抹耳廓,30 s后,耳血管擴(kuò)張、充血.用手輕拉耳尖,以單面剃須刀或尖的手術(shù)刀片,快速切開(kāi)動(dòng)脈或靜脈,血液即流出,每次可收集30~40 m L.然后用棉球壓迫止血,凝血后洗去二甲苯.二星期后,可在另一耳放血.此法可反復(fù)多次放血.頸動(dòng)脈放血時(shí),將兔仰臥,固定于兔臺(tái),剪去頸部的毛,切開(kāi)皮膚,暴露頸動(dòng)脈,插管,放血.取收集的血液在37℃恒溫箱中放置30 min以防止激活補(bǔ)體系統(tǒng),再將試管在4℃放置過(guò)夜使血液凝固.用藥鏟將血凝塊從管壁上撥落,將血液轉(zhuǎn)移至塑料離心管中,于4℃下4 000 r/min離心10 min.在無(wú)菌條件,吸出血清,分裝,可在-20℃保存數(shù)年.

    1.2.2 抗體的純化 具體步驟如下[5]:

    a.抗原柱子的制備.找到相應(yīng)的血清和抗原、抗原的透析(對(duì)非包涵體蛋白)、活化beads、抗原與beads連接、封閉beads.

    b.抗血清的預(yù)處理.將解凍好的血清在3 600 r/min,條件下離心17 min;除去離心后浮在表面的脂肪,將血清轉(zhuǎn)移到標(biāo)記好的瓶子中備用,注意盡量不要將沉在管底的血細(xì)胞倒出;對(duì)免疫原是GST融合蛋白的血清,同時(shí)是純化抗原也是GST融合蛋白,此時(shí)需過(guò)GST柱子,吸附掉anti-GST的抗體.注意此時(shí)要留抗原小樣,做ELISA檢測(cè)看anti-GST的抗體有沒(méi)有除盡.

    c.beads與對(duì)應(yīng)的抗血清的結(jié)合.將連接好抗原的beads和對(duì)應(yīng)的抗血清一起孵育,封口后排氣,在轉(zhuǎn)子上固定好,孵育,室溫2 h或4℃過(guò)夜,讓血清流出純化管,收集,10 m L PBS洗滌三次.

    d.收集抗體.加入10 mL p H5.0甘氨酸,預(yù)洗脫,加入預(yù)冷的HCl洗脫液.同時(shí)檢測(cè)收集的抗體濃度,確定收集峰,收集濃度高抗體,于4℃暫時(shí)保存.

    e.濃縮和透析.將濃度不高的抗體吸水濃縮,注意放4℃保持低溫.濃縮好后透析.次日檢測(cè)收集的抗體濃度,確定收集峰.收集濃度高抗體,于4℃暫時(shí)保存.

    f.beads的清洗和保存.依次用Tris和PBS洗,加入甘油、防腐劑-20℃保存.

    1.2.3 ELISA 檢測(cè)[6-8]a.抗原包被.用抗原包被液(1 mol/L的 Na HCO3)稀釋抗原,50微升/孔,蛋白量為2~3μg/m L,孵育,室溫2 h或4℃過(guò)夜,用GST標(biāo)簽蛋白作對(duì)照.

    b.封閉.倒出孔內(nèi)溶液,拍干,每孔加入100 u L稀釋液 (3% 脫脂牛奶+PBST),封閉,放搖床上室溫孵育1 h.

    c.加一抗.倒出孔內(nèi)溶液,拍干,洗3次,每次5 min.倒出孔內(nèi)溶液,拍干,加入一抗,搖床上室溫孵育1 h.

    d.加二抗.倒出孔內(nèi)溶液,拍干,洗三次,每次5 min.倒出孔內(nèi)溶液,拍干,加入二抗,搖床上室溫孵育1 h.

    e.加底物顯色.TMB顯色液A、B按1∶1混合,100μL/孔,放搖床上15 min內(nèi)觀(guān)察結(jié)果,照相.

    f.SDS-PAGE電泳.電泳時(shí)間一般4~5 h,電壓為40 V較好,也可用60 V.電泳至溴酚藍(lán)剛跑出即可終止電泳,進(jìn)行轉(zhuǎn)膜.

    g.轉(zhuǎn) 膜.

    (1)轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備6張7.0~8.3 cm 的濾紙和1張7.3~8.6 cm的PVDF膜,將切好的PVDF膜置于甲醇上浸才可使用.

    (2)在加有轉(zhuǎn)移液的塑料盒里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和浸過(guò)的膜.

    (3)將夾子打開(kāi)使黑的一面保持水平.在上面墊一張海綿墊,用玻棒來(lái)回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡.

    (4)要先將玻璃板撬掉才可剝膠,撬的時(shí)候動(dòng)作要輕,要在兩個(gè)邊上輕輕的反復(fù)撬.撬一會(huì)兒玻璃板便開(kāi)始松動(dòng),直到撬去玻璃板.小心剝下分離膠蓋于濾紙上,用手調(diào)整使其與濾紙對(duì)齊,輕輕用玻棒搟去氣泡.在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡.最后蓋上另一個(gè)海綿墊,搟幾下就可合起夾子.整個(gè)操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行,要不斷的搟去氣泡,膜兩邊的濾紙不能相互接觸,接觸后會(huì)發(fā)生短路.

    (5)將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中,要使夾的黑面對(duì)槽的黑面,夾的白面對(duì)槽的紅面.電轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn)熱,在槽的一邊放一塊冰來(lái)降溫.一般用60 V轉(zhuǎn)移2 h或40 V轉(zhuǎn)移3 h.(6)轉(zhuǎn)完后將膜用1×麗春紅染液染5 min,然后用水沖洗掉沒(méi)染上的染液就可看到膜上的蛋白.將膜晾干備用.

    h.免疫反應(yīng).

    (1)將膜用TBS從下向上浸濕后,移至含有封閉液的平皿中,室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉1 h.

    (2)將一抗用TBST稀釋至適當(dāng)濃度,撕下適當(dāng)大小的一塊兒保鮮膜鋪于實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上,四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整;將抗體溶液加到保鮮膜上;從封閉液中取出膜,用濾紙吸去殘留液后,將膜蛋白面朝下放于抗體液面上,室溫下孵育1~2 h后,用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次,再用TBS洗一次.

    (3)準(zhǔn)備二抗稀釋液并與膜接觸,室溫下孵育1~2 h后,用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次,每次10 min;再用TBST洗一次,10 min,進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng).

    i.化學(xué)發(fā)光、顯影、定影[9-10].

    (1)將A和B兩種試劑在保鮮膜上等體積混合,1 min后,將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸,1 min后,將膜移至另一保鮮膜上,去盡殘液,包好,放入暗盒中.

    (2)在暗室中,將1×顯影液和定影液分別到入塑料盤(pán)中;在紅燈下取出膠片,用切紙刀剪裁適當(dāng)大??;打開(kāi)暗盒,把膠片放在膜上,一旦放上,便不能移動(dòng),關(guān)上暗盒,開(kāi)始計(jì)時(shí);根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間,一般為1 min或5 min,也可選擇不同時(shí)間多次壓片,以達(dá)最佳效果;曝光完成后,打開(kāi)暗盒,取出膠片,迅速浸入顯影液中顯影,待出現(xiàn)明顯條帶后,即刻終止顯影.顯影時(shí)間一般為1~2 min(20~25℃),顯影結(jié)束后,馬上把膠片浸入定影液中,定影時(shí)間一般為5~10 min,以膠片透明為止,用自來(lái)水沖去殘留的定影液后,室溫下晾干.

    2 結(jié)果與討論

    2.1 GST柱子分析

    免疫原是GST融合蛋白的血清,同時(shí)是純化GST柱子的穿流夜Ft GST融合蛋白,此時(shí)需過(guò)GST柱子,用來(lái)吸附掉anti-GST的抗體.圖1所示的是未過(guò)GST柱子的血清F和GST柱子的穿流液Ft加入TMB底物后顯色反應(yīng),表1所示的是血清F與穿流液Ft的稀釋梯度[11-12].

    表1 血清F與穿流液Ft的稀釋梯度Table 1 Dilution gradient of serum F and transit fluid Ft

    圖1 血清F(“1”)與穿流液Ft(“2”)的顯色反應(yīng)Fig.1 Chromogenic reaction of serum F and transit fluid

    由圖1和表1可知:在四種梯度下,血清F加TMB底物顯色后四孔全部顯藍(lán)色,而穿流液Ft全部無(wú)色,說(shuō)明anti-GST已除干凈.

    2.2 ELISA結(jié)果分析

    圖2所示的是未過(guò)GST柱子的血清F、GST柱子的穿流液Ft和抗體Pu加入TMB底物后顯色反應(yīng)、表2所示的是血清F、穿流液Ft和抗體Pu的稀釋梯度.

    圖2 血清F、穿流液Ft、抗體Pu的顯色反應(yīng)Fig.2 Chromogenic reaction of serum F,transit fluid Ft and antibody Pu

    由圖2和表2可知,以Ft為參照,F(xiàn)、Ft、Pu顯色孔數(shù)依次為4,3,4,其中Ft的是底色.結(jié)果說(shuō)明血清還可以進(jìn)一步純化,而且收集的純化血清效果也不錯(cuò),即稀釋度為1:500 000.

    表2 血清F、穿流液Ft、抗體Pu的稀釋梯度Table 2 Dilution gradient of serum F,transit fluid Ft and antibody Pu

    2.3 SDS-PAGE測(cè)定 ATG 12多克隆抗體濃度[13]

    使用SDS-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,圖3所示的是ATG12多克隆抗體的SDS-PAGE圖.如圖3所示:左邊的條帶為ATG12蛋白,右邊為marker條帶,marker的分子質(zhì)量圖中已經(jīng)標(biāo)出.以67 k D為參照來(lái)估測(cè)蛋白濃度,67 k D代表的marker質(zhì)量濃度為每10μL含8μg,而目的蛋白的顏色只有其5/8深,則蛋白濃度為每10μL 5/8×8μg,即每10μL為5μg.

    圖3 ATG12多克隆抗體的SDS-PAGEFig.3 SDS-PAGE of ATG12 polyclonal antibody

    圖4 免疫印記蛋白質(zhì)大小Fig.4 Size of Immune mark protein

    2.4 Western blotting分析

    圖4所示的是免疫印記蛋白質(zhì)大小及在Colon(結(jié)腸)中的表達(dá)條帶中的表達(dá)情況.

    由圖4可知:Western blotting條帶上的點(diǎn)清晰,說(shuō)明其能在結(jié)腸中較好的表達(dá),由圖知蛋白質(zhì)大小為55 k D左右.

    3 結(jié) 語(yǔ)

    使用帶GST標(biāo)簽的融合蛋白免疫新西蘭大白兔,制備得到ATG12多克隆抗體,運(yùn)用ELISA及Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示此抗體效價(jià)及特異性較高,Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示其在結(jié)腸組織中表達(dá),SDS-PAGE結(jié)果顯示其濃度也較高.本研究成功得到濃度較高的ATG12多克隆抗體,并證實(shí)其在結(jié)腸組織中表達(dá)較明顯.

    致謝

    感謝天惠生物公司對(duì)本研究的支持與幫助.

    [1]周建光,楊梅.免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展及臨床應(yīng)用[J].醫(yī)療裝備,2011,24(7):49-51.

    [2]孔維,楊文輝.單克隆抗休及其應(yīng)用的研究進(jìn)展[J]畜牧獸醫(yī)科技信息,2009(1):9-11.

    [3]Ashford T P,Porter K R.Cytoplasmic components in hepatic cell lysosomes[J].The Journal of cell biology,1962(1):198-202.

    [4]譚榮榮,劉明炎,龔自明.茶尺蠖核型多角體病毒多克隆抗體的制備及檢測(cè)應(yīng)用[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,51(2):298-301.

    [5]張花美,李因來(lái),潘熙萍.抗麥草畏多克隆抗體v的制備及其間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的建立[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào):農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版,2012,38(2):153-158.

    [6]Susumu H T,Suzuki K,Akahori Y.Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity is induced by a single-chain Fv-protein III fusion in the presence of a rabbit anti-protein III polyclonalantibody[J].Immunology Letters,2011,136(1):44-48.

    [7]Horiguchi T,Urushitani H,Ohta Y.Establishment of a polyclonal antibody against the retinoid X receptor of the rock shell Thais clavigera and its application to rock shell tissues for imposex research[J].Ecotoxicology,2010,19(3):571-576.

    [8]Xu M Y,Wang S D.Prokaryotic expression of pathogenesis related protein 1 gene from Nicotiana benthamiana:antifungal activity and preparation of its polyclonal antibody[J].Biotechnology Letters,2012,34(5):919-924.

    [9]Anderson G J,Cipolla C M,Kennedy R T.Western Blotting Using Capillary Electrophoresis[J].Analytical chemistry,2011,83(4):1350-1355.

    [10]Welinder C,Ekblad L.Coomassie Staining as Loading Control in Western Blot Analysis[J].Journal of proteome research,2011,10(3):1416-1419.

    [11]Rath A,Glibowicka M,Nadeau V G.Detergent binding explains anomalous SDS-PAGE migration of membrane proteins[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2009,106(6):1760-1765.

    [12]Hans J C,Wessels R O.LC-MS/MS as an alternative for SDS-PAGE in blue native analysis of protein complexes[J].Cell & Molecular Biology,2009,9(17):4221-4228.

    [13]Riechers A,Schmidt F,Stadlbauer S.Detection of Protein Phosphorylation on SDS-PAGE Using Probes with a Phosphate-Sensitive Emission Response[J].Bioconjugate Chemistry,2009,20(4):804-807.

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