氣相色譜法檢測(cè)魚和蝦中復(fù)硝酚鈉殘留量*

邢麗紅，冷凱良，孫偉紅，翟毓秀，李兆新，譚志軍，苗鈞魁

(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071)

復(fù)硝酚鈉是一種魚、蝦促生長(zhǎng)藥物添加劑，該藥在國(guó)內(nèi)外曾廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中。復(fù)硝酚鈉是由鄰硝基酚鈉、對(duì)硝基酚鈉、2-甲氧基-5-硝基苯酚鈉及其他助劑加工而成，具有促進(jìn)生長(zhǎng)、提高產(chǎn)量等作用[1]。研究表明，復(fù)硝酚鈉為弱致敏物[2]，對(duì)哺乳動(dòng)物體細(xì)胞和雄性生殖細(xì)胞無(wú)致突變作用[3-5]。雖然急性毒性和慢性毒性實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示復(fù)硝酚鈉毒性較低，但目前的毒理學(xué)數(shù)據(jù)還不充分，長(zhǎng)期食用含復(fù)硝酚鈉殘留的水產(chǎn)品可能會(huì)對(duì)消費(fèi)者的健康造成潛在危害。我國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第193號(hào)“食品動(dòng)物禁用的獸藥及其它化合物清單”將硝基酚鈉列為禁用藥物。

酚類化合物常用的檢測(cè)方法主要有液相色譜法[6-10]、液相色譜-質(zhì)譜法[11-15]，氣相色譜法[16-19]、氣相色譜-質(zhì)譜法[20-27]等。液相色譜-紫外檢測(cè)法不需要衍生化，在測(cè)定酚類化合物時(shí)比氣相色譜法的應(yīng)用更廣泛[9]。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法雖然可以對(duì)酚類化合物進(jìn)行測(cè)定，并具有較高的靈敏度和專一性，但需要配備APCI離子源。高效液相色譜-熒光法因其具有高選擇性和靈敏性具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，然而有些酚類化合物沒(méi)有熒光特性，因此需要通過(guò)柱后衍生轉(zhuǎn)化成具有強(qiáng)熒光特性的物質(zhì)[6-7,10]。氣相色譜法因其分離速度快、成本低、靈敏度高等特點(diǎn)而備受青睞。酚類化合物屬于強(qiáng)極性化合物，直接分析導(dǎo)致寬峰、拖尾峰及高檢出限，通常需要先衍生降低極性后再進(jìn)氣相色譜分析[20-27]?，F(xiàn)有的檢測(cè)方法主要針對(duì)水溶液中的酚類化合物進(jìn)行分析，檢測(cè)動(dòng)物組織中硝基酚鈉殘留量的研究報(bào)道較少。由于動(dòng)物基質(zhì)組成復(fù)雜，再加上部分酚類化合物具有揮發(fā)性，增加了其在動(dòng)物組織中提取、凈化及濃縮的難度。本文旨在建立一種魚和蝦中對(duì)硝基酚鈉、鄰硝基酚鈉和2-甲氧基-5-硝基苯酚鈉的提取凈化方法及乙酸酐作為衍生化試劑柱前衍生的氣相色譜檢測(cè)法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 7890A氣相色譜儀(GC)，配有ECD檢測(cè)器；高速離心機(jī)(Thermo Scientific)，渦旋混合器(Talboys)，KQ-600DE超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Heidoplh公司)，N-EVAP 111氮吹儀(Organomation公司)，超純水機(jī)(Milli-Q公司)。

對(duì)硝基酚鈉標(biāo)準(zhǔn)品、2-甲氧基-5-硝基苯酚鈉標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司)，鄰硝基酚鈉標(biāo)準(zhǔn)品(東京化成工業(yè)株式會(huì)社)；乙酸乙酯、正己烷(色譜純，Merck)；無(wú)水碳酸鉀、乙酸酐、無(wú)水硫酸鈉(分析純)；酸性氧化鋁(層析用，100～200目)；Milli-Q超純水；酸性氧化鋁凈化柱(自制)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品提取和凈化 稱取5 g勻漿后的樣品于50 mL離心管中，加入15 mL乙酸乙酯，旋渦混合1 min，超聲提取10 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液于50 mL離心管中，過(guò)酸性氧化鋁凈化柱(事先用5 mL乙酸乙酯活化)，收集流出液。殘?jiān)性偌尤?0 mL乙酸乙酯重復(fù)提取一遍，上清液過(guò)凈化柱，用5 mL乙酸乙酯淋洗，合并淋洗液。

在乙酸乙酯中加入4 mL 0.1 mol/L碳酸鉀溶液，旋渦混合1 min，4 000 r/min離心10 min，取碳酸鉀層于50 mL離心管中，用4 mL碳酸鉀溶液重復(fù)提取一次，合并碳酸鉀層。將乙酸乙酯層轉(zhuǎn)移50 mL雞心瓶中，40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。將碳酸鉀轉(zhuǎn)移至雞心瓶中，渦旋混合1 min，再加入5 mL正己烷，渦旋混合1 min，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，4 000 r/min離心10 min。將碳酸鉀層轉(zhuǎn)移至25 mL比色管中，待用。

1.2.2 衍生化 試樣的衍生化：碳酸鉀溶液中加入0.2 mL乙酸酐，振搖3 min，加入2.5 mL正己烷萃取，正己烷萃取液轉(zhuǎn)移至5 mL棕色容量瓶中，再加入2 mL正己烷重復(fù)萃取一次，合并正己烷萃取液，定容至5 mL。加入2 g無(wú)水硫酸鈉，充分渦旋混合均勻，將溶液轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶，待測(cè)。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的衍生化：準(zhǔn)確吸取一定量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別置于25 mL具塞比色管中，加入8 mL碳酸鉀溶液，按照上述步驟進(jìn)行衍生化，使最終濃度分別為5、10、20、50、100 μg/L，制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.2.3 氣相色譜條件 色譜柱：DB-1701毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度250 ℃；檢測(cè)器溫度300 ℃；柱升溫程序：起始溫度120 ℃，然后以15 ℃/min 升溫至180 ℃，再以20 ℃/min升溫至250 ℃，保持5 min；載氣為氮?dú)?φ=99.999%)，流速1.5 mL/min；尾吹氣為氮?dú)猓?0.0 mL/min；進(jìn)樣量1 μL，不分流進(jìn)樣；吹掃放空流量60.0 mL/min，吹掃放空時(shí)間0.75 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

常用的提取溶劑主要有乙腈、丙酮、乙酸乙酯等，乙腈和丙酮與組織的兼容性較好，且具有沉淀蛋白的作用，乙腈還有去除部分脂肪的作用，但乙腈和丙酮同時(shí)也將更多的雜質(zhì)提取出來(lái)，在對(duì)、鄰硝基酚鈉出峰處均有干擾。實(shí)驗(yàn)表明，鄰硝基苯酚具有揮發(fā)性，在濃縮操作時(shí)較難控制，即使在常溫下也會(huì)損失49.1%～100%。乙酸乙酯的毒性較乙腈和丙酮都小，既能將目標(biāo)化合物提取出來(lái)，又可以通過(guò)液液萃取將部分對(duì)硝基酚鈉、2-甲氧基-5-硝基苯酚鈉以及φ=82.7%以上的鄰硝基酚鈉轉(zhuǎn)移至K2CO3緩沖溶液中，保留在乙酸乙酯中的剩余部分硝基酚鈉經(jīng)濃縮后再合并至K2CO3溶液中，且出峰處無(wú)干擾，峰形尖銳對(duì)稱。采用乙酸乙酯作為提取溶劑、K2CO3緩沖溶液進(jìn)行萃取，3種化合物的回收率均在91.5%以上。實(shí)驗(yàn)還分別比較了不同濃度K2CO3緩沖溶液的萃取效果及綜合回收率(見(jiàn)圖1)，最終確定乙酸乙酯為提取溶劑，緩沖溶液的濃度為0.1 mol/L。

圖1 硝基酚鈉在乙酸乙酯和 K2CO3溶液中的回收率對(duì)比圖(n=3)Fig.1 Recovery ratios of sodium nitrophenolate in ethyl acetate and potassium carbonate solutions(n=3)

2.2 凈化方法的確定

本文考察了酸性氧化鋁和正己烷的凈化效果及回收率。緩沖溶液中脂肪酸的存在會(huì)形成果凍狀物質(zhì)而影響前處理操作，對(duì)衍生化反應(yīng)造成干擾。脂肪酸能夠溶解在乙酸乙酯中，采用K2CO3緩沖溶液從乙酸乙酯中萃取硝基酚鈉的同時(shí)，也會(huì)將脂肪酸提取出來(lái)生成脂肪酸鉀。本文首先采用酸性氧化鋁對(duì)乙酸乙酯提取液進(jìn)行凈化，而后采用正己烷對(duì)K2CO3緩沖溶液進(jìn)一步凈化，可以有效去除脂肪酸鉀和脂肪等雜質(zhì)，凈化后三種化合物的回收率均能達(dá)到90%以上。實(shí)驗(yàn)表明，本方法能避免脂肪含量較高的水產(chǎn)樣品在衍生化操作時(shí)發(fā)生乳化現(xiàn)象。

2.3 衍生化反應(yīng)條件的確定

硝基酚鈉屬于強(qiáng)極性化合物，需要選擇合適的衍生化試劑將其極性降低后再進(jìn)氣相色譜儀分析[12,26]。衍生化方法主要有酰化、硅烷化、烷基化等[23-26], 常用的衍生化試劑主要有乙酸酐、五氟苯甲酰氯、七氟丁酸酐、五氟溴等。五氟苯甲酰氯、七氟丁酸酐等衍生化試劑在水溶液中容易降解、價(jià)格昂貴、衍生化時(shí)間長(zhǎng)，而乙酸酐在堿性條件下，在室溫幾分鐘甚至在水溶液中即可完成衍生化過(guò)程，相對(duì)其它衍生化試劑更廉價(jià)，易于操作[24]。硝基苯酚與乙酸酐反應(yīng)可以生成硝基苯乙酸酯，但乙酸酐不能衍生所有的硝基苯酚和二硝基苯酚[20]。本實(shí)驗(yàn)以乙酸酐作為衍生劑進(jìn)行研究，并對(duì)其衍生條件進(jìn)行考察和優(yōu)化，得到最優(yōu)衍生化條件。

2.3.1 衍生化反應(yīng)緩沖溶液的選擇 Padilla-Sánchez等[24]用吡啶來(lái)提供堿性環(huán)境，Regueiro等[26]選擇磷酸氫二鈉提供堿性環(huán)境。而本文分別比較了K2CO3、Na2CO3、飽和NaHCO3作為衍生化反應(yīng)緩沖溶液的衍生化效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用Na2CO3、飽和NaHCO3作為衍生化反應(yīng)緩沖溶液，雖然都能夠生成衍生化產(chǎn)物，但采用Na2CO3和飽和NaHCO3作為衍生化反應(yīng)緩沖溶液，基線噪音較大，在對(duì)硝基酚鈉和鄰硝基酚鈉出峰處有干擾，其靈敏度比使用K2CO3作為緩沖液時(shí)低近1倍。實(shí)驗(yàn)還考察了將標(biāo)準(zhǔn)溶液吹干后直接加入乙酸酐進(jìn)行衍生，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在沒(méi)有堿性溶液存在的條件下，三種目標(biāo)化合物均無(wú)法衍生。最終本方法選擇0.1 mol/L K2CO3溶液作為衍生化反應(yīng)緩沖溶液。

2.3.2 衍生化反應(yīng)試劑用量的考查 在8 mL 0.1 mol/L碳酸鉀溶液中加入1 mg/L硝基酚鈉混合標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，渦旋混合均勻后，分別加入10、20、50、100、150、200、250、300 μL衍生化試劑再進(jìn)氣相色譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 衍生化試劑用量與衍生化產(chǎn)物關(guān)系圖Fig.2 Relationship curves of the amount of derivatization agent and derivatives

結(jié)果表明，隨著衍生化試劑用量的增加，衍生化反應(yīng)產(chǎn)物也隨之增加，當(dāng)衍生化試劑的用量超過(guò)150 μL時(shí)，對(duì)硝基酚鈉、鄰硝基酚鈉、2-甲氧基-5-硝基苯酚鈉衍生化產(chǎn)物的生成量均趨于平穩(wěn)，繼續(xù)增加衍生化試劑用量，產(chǎn)物沒(méi)有顯著增加。衍生化試劑用量在200 μL時(shí)，既能保證衍生化反應(yīng)順利進(jìn)行，又可以避免浪費(fèi)。最終確定反應(yīng)底物(硝基酚鈉復(fù)合物)與衍生化試劑的用量體積比為1∶2 000。Padilla-Sánchez等[24]對(duì)乙酸酐和吡啶的用量進(jìn)行考察，確定乙酸酐用量為100 μL，吡啶20 μL，與本實(shí)驗(yàn)乙酸酐的用量有差異，而Regueiro等[26]在衍生化氯苯酚等時(shí)乙酸酐用量為200 μL，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。而對(duì)于實(shí)際未知樣品，衍生化試劑的用量既要保證足量，又要避免浪費(fèi)，綜合考慮確定衍生化試劑的用量為200 μL。

2.3.3 衍生化反應(yīng)時(shí)間和溫度的選擇 實(shí)驗(yàn)分別考察了不同衍生化反應(yīng)溫度和不同衍生化反應(yīng)時(shí)間對(duì)衍生化產(chǎn)物生成量的影響(見(jiàn)圖3)。結(jié)果顯示，衍生化反應(yīng)初期，生成產(chǎn)物相對(duì)穩(wěn)定，隨著衍生化反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，衍生化產(chǎn)物的量呈逐漸減少的趨勢(shì)。衍生化反應(yīng)初期，隨著衍生化溫度的升高，衍生化產(chǎn)物生成的量有所增大，隨著衍生化時(shí)間的延長(zhǎng)，衍生化產(chǎn)物的生成量呈下降趨勢(shì)。從圖3可以看出，40 ℃下衍生10 min和常溫下衍生10 min相比，40 ℃時(shí)衍生化產(chǎn)物具有更高的生成量，但在5～15 min范圍內(nèi)，其生成量不穩(wěn)定，變化率較常溫下大，對(duì)于批量樣品操作而言，常溫下衍生的結(jié)果更穩(wěn)定一些。此外，常溫下不需要進(jìn)行額外的加熱操作，更簡(jiǎn)便，綠色，環(huán)保，在考慮滿足檢測(cè)靈敏度的前提下，最終確定衍生化反應(yīng)在常溫下進(jìn)行，衍生化反應(yīng)時(shí)間為10 min。

圖3 鄰硝基酚鈉、對(duì)硝基酚鈉和2-甲氧基-5-硝基苯酚鈉和時(shí)間-溫度曲線圖Fig.3 Time-temperature curves of o-nitrophenol sodium, p-nitrophenol sodium and 2-methoxy-5-nitropenolate sodium

2.4 色譜條件的選擇

柱溫對(duì)分離度影響很大，經(jīng)常是條件選擇的關(guān)鍵。初始溫度的選擇對(duì)色譜峰具有重要的影響，初始溫度高，對(duì)硝基酚鈉和鄰硝基酚鈉兩個(gè)目標(biāo)化合物峰相重疊，降低初始溫度至120 ℃，同時(shí)比較不同升溫速率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以15 ℃/min速率升溫，既能使對(duì)硝基酚鈉和鄰硝基酚鈉達(dá)到很好的分離效果，又能縮短出峰時(shí)間。硝基酚鈉屬于強(qiáng)極性化合物，與乙酸酐衍生化后極性降低，實(shí)驗(yàn)分別比較了DB-1701和DB-5氣相毛細(xì)管色譜柱的分離效果，結(jié)果表明，DB-1701毛細(xì)管色譜柱具有適宜的保留時(shí)間、對(duì)稱的峰形和良好分離效果，且不受基質(zhì)干擾。DB-1701屬于中極性色譜柱，為了能夠盡快將雜質(zhì)吹出，同時(shí)還能有效保護(hù)色譜柱，其最高溫度應(yīng)不高于250 ℃。氣化室溫度取決于樣品的揮發(fā)性、沸點(diǎn)及進(jìn)樣量，本實(shí)驗(yàn)選擇氣化室溫度250 ℃，可以保證3種化合物迅速完全氣化，又不發(fā)生降解。為了使色譜柱的流出物不在檢測(cè)器中冷凝而污染檢測(cè)器，檢測(cè)室溫度需高于柱溫30～50 ℃，本實(shí)驗(yàn)選擇檢測(cè)器溫度300 ℃。

2.5 方法檢出限、回收率和精密度

2.5.1 線性范圍和檢出限 在本實(shí)驗(yàn)所建立的色譜條件下，以色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)的濃度(x)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)硝基酚鈉、鄰硝基酚鈉、2-甲氧基-5-硝基苯酚鈉標(biāo)準(zhǔn)工作液在5～100 μg/L濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表1。

檢出限是采用添加法進(jìn)行實(shí)測(cè)確定的。按照信噪比S/N=3和S/N=10確定方法的檢測(cè)限和定量限分別為5和10 μg/kg。草魚空白樣品及加標(biāo)樣品色譜圖見(jiàn)圖4。Padilla-Sánchez等[24]研究表明，有些酚類化合物在低濃度點(diǎn)的回收率并不穩(wěn)定，確定對(duì)硝基苯酚等酚類化合物的定量限為10 μg/kg，與本研究結(jié)果相一致。

2.5.2 回收率和精密度 分別以草魚、鱈魚和南美白對(duì)蝦為測(cè)試對(duì)象，在空白樣品中添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照實(shí)驗(yàn)方法對(duì)樣品進(jìn)行處理，計(jì)算平均回收率。同一添加水平平行測(cè)定6份樣品，并計(jì)算RSD，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 硝基酚鈉的線性范圍與方法檢出限Table 1 Limit of the detection, linear range and regression equation of sodium nitrophenolate samples

圖4 草魚樣品中硝基酚鈉加標(biāo)(a)及空白樣品(b)色譜圖Fig.4 GC chromatograms of grass carp added with various sodium nitrophenolate samples(a)compared with the blank(b)

化合物添加水平/(μg·kg-1)草魚回收率/%RSD/%鱈魚回收率/%RSD/%南美白對(duì)蝦回收率/%RSD/%對(duì)硝基酚鈉1087682866958778430864728866889662100880588736487567鄰硝基酚鈉108289484088839101308327983864843871008366483474831682?甲氧基?5?硝基苯酚鈉1091380903649057230922638997589664100906429125690153

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

應(yīng)用本方法分析了青島市場(chǎng)上隨機(jī)抽取的5份樣品，分別是鱸魚、大黃魚、草魚、對(duì)蝦和大菱鲆，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有1份樣品中檢出鄰硝基酚鈉，其含量低于10 μg/kg，對(duì)硝基酚鈉和5-硝基鄰甲氧基苯酚鈉在這5份樣品中均未檢出。

3 結(jié) 論

建立了氣相色譜檢測(cè)魚和蝦中對(duì)硝基酚鈉、鄰硝基酚鈉和2-甲氧基-5-硝基鄰甲氧基苯酚鈉的方法。方法檢測(cè)限為5 μg/kg, 定量限為10 μg/kg，線性范圍為5～ 100 μg/L, 相關(guān)系數(shù)R2>0.999,回收率介于82.8%～92.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均<15%。該法靈敏、準(zhǔn)確，可用于魚和蝦中硝基酚鈉殘留量的檢測(cè)。

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