激動網(wǎng)織紅核因子相關(guān)因子2對大鼠氧化應(yīng)激所致血管平滑肌細胞損傷的影響

馮 健, 何國祥, 劉建平, 景 濤

?

激動網(wǎng)織紅核因子相關(guān)因子2對大鼠氧化應(yīng)激所致血管平滑肌細胞損傷的影響

馮 健, 何國祥*, 劉建平, 景 濤

（第三軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院心血管內(nèi)科, 重慶 400038）

探討激動網(wǎng)織紅核因子相關(guān)因子2（Nrf2）對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細胞（VSMCs）損傷的影響。原代培養(yǎng)大鼠VSMCs，隨機分為4組：對照組、氧化損傷組、Nrf2激動劑組、Nrf2干擾慢病毒組。Western免疫印跡法檢測Nrf2蛋白表達變化，MTT法檢測各組細胞活力，Hoechst 33342法及Annexin V/FITC法檢測各組細胞凋亡情況。熒光顯微鏡顯示，Nrf2干擾慢病毒成功感染VSMCs；Western免疫印跡檢測顯示，Nrf2干擾慢病毒感染細胞后，Nrf2蛋白表達與對照組比較顯著降低（＜0.05）。與氧化損傷組比較，Nrf2激動劑組VSMCs活力顯著增加（＜0.05），細胞凋亡顯著降低（＜0.05）；而Nrf2干擾慢病毒組VSMCs活力顯著減弱（＜0.05），細胞凋亡明顯增加（＜0.05）。激動Nrf2能減輕氧化應(yīng)激引起的VSMCs損傷，這可為VSMCs損傷的防治提出新的研究方向。

網(wǎng)織紅核因子相關(guān)因子2; 氧化應(yīng)激; 血管平滑肌細胞

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）及其相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展與血管老化有著密切的聯(lián)系。氧化應(yīng)激參與了血管老化并在血管老化中扮演著重要的角色。減輕血管細胞氧化應(yīng)激損傷，對延緩細胞衰老，防治AS的發(fā)生有重要意義[1,2]。網(wǎng)織紅核因子相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）是近來發(fā)現(xiàn)的調(diào)控細胞內(nèi)氧化應(yīng)激的主要轉(zhuǎn)錄因子。因此，本研究以血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）為研究對象，觀察激動Nrf2對氧化應(yīng)激導(dǎo)致VSMCs損傷的影響，以期為VSMCs損傷的防治提出新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料

出生3～4周的清潔級Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠，購于第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心；齊墩果酸（美國Sigma公司）；胎牛血清、達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)液（美國Gibco公司）；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（北京四正柏生物科技有限公司）；Hoechst 33342（碧云天生物技術(shù)研究所）；Western blot化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（美國 Amersham公司）；其他試劑為國產(chǎn)分析純或進口分裝。

1.2 大鼠血管平滑肌細胞培養(yǎng)及鑒定

參照文獻[3]方法進行，斷頸處理雄性SD大鼠后，無菌條件下分離大鼠主動脈血管，采用貼塊法培養(yǎng)細胞，0.25%胰酶消化傳代并純化后，經(jīng)倒置相差顯微鏡及免疫組織化學(xué)鑒定為VSMCs，4～8代細胞用于實驗。

1.3 實驗分組

將用于實驗的VSMCs隨機分為4組：（1）對照組：不加干預(yù)因素；（2）氧化損傷組：加入過氧化氫（H2O2）；（3）Nrf2激動劑組：加入H2O2及Nrf2激動劑齊墩果酸；（4）Nrf2干擾慢病毒組：加入H2O2并感染Nrf2干擾慢病毒。每個組均重復(fù)4次（＝4）。

1.4 Nrf2干擾慢病毒感染細胞

參照文獻[4]方法包裝Nrf2干擾慢病毒后，將Nrf2干擾慢病毒液用移液器加入細胞培養(yǎng)液中感染各組VSMCs，24h換液1次，72h后可在熒光顯微鏡下觀察細胞感染情況。

1.5 Western免疫印跡法檢測蛋白表達

提取細胞蛋白并繪制標準曲線，測定樣品濃度，灌膠，上樣量為50μg，電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入一抗、二抗后用凝膠掃描成像，圖像分析軟件進行分析。

1.6 MTT法檢測細胞活力

接種VSMCs于96孔板，用無血清DMEM培養(yǎng)24h后，加入干預(yù)因素，繼續(xù)放入37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)相應(yīng)的時間后，每孔加入20μl MTT工作液，繼續(xù)放入37℃、5%CO2中孵育4h；小心吸掉培養(yǎng)孔中上清液，每孔加入150μl DMSO，震蕩10min，使結(jié)晶物質(zhì)充分溶解并在酶標儀490nm波長處檢測吸光度值。

1.7 Hoechst 33342檢測細胞凋亡

將干預(yù)后的細胞取出，加入0.25%胰酶消化后，離心，去上清；用1ml 4%多聚甲醛的PBS重懸細胞，室溫10min；離心，用PBS洗2次，加入5μl Hoechst 33342染色液；用移液槍混勻溶液后，冰浴10min；再次離心后，去上清，并用PBS洗1次；涂片，在熒光顯微鏡下觀察藍色熒光。

1.8 流式細胞儀檢測細胞凋亡

將VSMCs干預(yù)后，按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，在流式細胞儀上檢測細胞凋亡情況。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 Nrf2干擾慢病毒感染大鼠VSMCs及Nrf2蛋白表達

將Nrf2干擾慢病毒液加入細胞培養(yǎng)液中感染VSMCs，培養(yǎng)24h后換液1次，72h后可在熒光顯微鏡下觀察細胞綠色熒光表達（圖1）。提取細胞核蛋白，Western 免疫印跡結(jié)果表明，與對照組比較，感染Nrf2干擾慢病毒后細胞Nrf2蛋白表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05；圖2）。

圖1 Nrf2干擾慢病毒感染VSMCs

Figure 1 VSMCs are infected by Nrf2 siRNA-expressing lentiviral vector

VSMCs:血管平滑肌細胞。A: 熒光顯微鏡下照片(×100); B: 光鏡下照片(×100)

圖2 干擾后VSMCs中Nrf2蛋白表達變化

Figure 2 Protein levels of Nrf2 in VSMCs after infection

VSMCs: 血管平滑肌細胞; Nrf2: 網(wǎng)織紅核因子相關(guān)因子2。與對照組比較,＜0.05

2.2 激動Nrf2對大鼠VSMCs氧化應(yīng)激損傷的影響

MTT結(jié)果表明，與對照組比較，氧化損傷組VSMCs吸光度值顯著降低（＜0.05）；加入Nrf2激動劑齊墩果酸后，VSMCs吸光度值與氧化損傷組比較顯著增加（＜0.05）；而感染Nrf2干擾慢病毒后，VSMCs吸光度值再次降低（＜0.05；表1）。

Annexin V結(jié)果顯示，與對照組比較，氧化損傷組VSMCs凋亡率顯著升高（＜0.05）；與氧化損傷組比較，Nrf2激動劑組VSMCs凋亡率顯著降低（＜0.05）；與氧化損傷組比較，Nrf2干擾慢病毒組VSMCs凋亡率明顯升高（＜0.05；表1）。

表1 各組VSMCs活性及凋亡的變化

注: VSMCs: 血管平滑肌細胞。與對照組比較,P＜0.05; 與氧化損傷組比較,#＜0.05

Hoechst 33342結(jié)果再次顯示，對照組細胞核呈藍色；給予H2O2處理后大量細胞核呈致密濃染。給予Nrf2激動劑預(yù)處理后，再加入H2O2培養(yǎng)24h，大量細胞核呈藍染，有少許細胞核呈致密濃染；當感染Nrf2干擾慢病毒后，VSMCs抗氧化應(yīng)激損傷作用被削弱，大量細胞核呈致密濃染（圖3）。

3 討 論

越來越多的研究表明，AS血管中的細胞處于老化狀態(tài)，血管老化是隨著時間和細胞分裂、生長及功能逐漸喪失的過程，在血管老化的過程中，大量的自由基不斷地生成，從而導(dǎo)致羥自由基的過度產(chǎn)生，進一步加劇血管老化與損傷[5,6]。VSMCs是血管壁的重要血管細胞之一，是血管抵御外界刺激的第一道屏障。大量的證據(jù)表明，VSMCs在老化中的改變與氧化和抗氧化的平衡有關(guān)。VSMCs在氧化應(yīng)激的作用下產(chǎn)生適應(yīng)性修飾則不可避免地引起血管老化[7]。

Nrf2是一種重要的核轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因，參與了一系列抗氧化基因的表達調(diào)控，其激活后可以啟動下游多種抗氧化基因的表達，作用涉及到AS的多個層面和環(huán)節(jié)[8]。VSMCs凋亡會導(dǎo)致AS斑塊的不穩(wěn)定，甚至發(fā)生破裂。因此，本研究以H2O2誘導(dǎo)VSMCs產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，實驗發(fā)現(xiàn)，給VSMCs予以H2O2（400μmol/L）后，VSMCs凋亡顯著增加。在本實驗中，我們給予Nrf2激動劑齊墩果酸后，H2O2導(dǎo)致的VSMCs凋亡顯著降低，并且激動Nrf2能增加細胞活力；而Nrf2干擾慢病毒感染VSMCs后，H2O2導(dǎo)致的VSMCs活力明顯下降，細胞凋亡明顯增加。這可能與干擾Nrf2后，細胞內(nèi)Ⅱ相抗氧化酶基因表達減少，削弱了VSMCs的抗氧化應(yīng)激損傷的能力有關(guān)[9]。近來也有研究表明轉(zhuǎn)染Nrf2基因?qū)SMCs的生長發(fā)揮抑制作用[10]。Kim等[11]研究也表明血紅素氧合酶-1介導(dǎo)了Nrf2抑制VSMCs增殖的作用。上述研究結(jié)果與本實驗的差異，可能是因為不同的實驗條件、不同的刺激因素以及時相性，引起了Nrf2啟動相應(yīng)效應(yīng)的結(jié)果。因此，在選擇依賴于Nrf2的治療措施時，應(yīng)綜合考慮這些因素。

圖3 Hoechst 33342檢測各組細胞凋亡情況

Figure 3 Cell apoptosis were detected by Hoechst 33342 (Hoechst 33342×200)

A: 對照組; B: 氧化損傷組; C: Nrf2激動劑組; D: Nrf2干擾慢病毒組

綜上所述，激動Nrf2能減輕氧化應(yīng)激狀態(tài)下VSMCs凋亡，提高細胞活力，提示Nrf2可能是防治VSMCs損傷的新靶點。但本實驗未直接對激動Nrf2后VSMCs的老化及其具體機制進行深入具體的探討，而且激動Nrf2后的體內(nèi)療效尚有待今后進一步研究。

[1] Liu Y, Chen KJ. Atherosclerosis, vascular aging and therapeutic strategies[J]. Chin J Integr Med, 2012, 18(2): 83-87.

[2] Dal-Ros S, Bronner C, Auger C,. Red wine polyphenols improve an established aging-related endothelial dysfunction in the mesenteric artery of middle-aged rats: role of oxidative stress[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2012, 419(2): 381-387.

[3] 馮 健, 何國祥. 齊墩果酸對過氧化氫誘導(dǎo)血管平滑肌細胞凋亡的影響[J]. 中華老年心腦血管病雜志, 2012, 14(1): 66-68.

[4] Feng J, Zhang P, Chen X,. PI3K and ERK/Nrf2 pathways are involved in oleanolic acid-induced heme oxygenase-1 expression in rat vascular smooth muscle cells[J]. J Cell Biochem, 2011, 112(6): 1524-1531.

[5] Patel RS, AI Mheid I, Morris AA,. Oxidative stress is associated with impaired arterial elasticity[J]. Atherosclerosis, 2011, 218(1): 90-95.

[6] Collins AR, Lyon CJ, Xia X,. Age-accelerated atherosclerosis correlates with failure to upregulate antioxidant genes[J]. Circ Res, 2009, 104(6): e42-54.

[7] Ungvari Z, Bailey-Downs L, Sosnowska D,. Vascular oxidative stress in aging: a homeostatic failure due to dysregulation of NRF2-mediated antioxidant response[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2011, 301(2): H363-372.

[8] Li J, Ichikawa T, Janicki JS,. Targeting the Nrf2 pathway against cardiovascular disease[J]. Expert Opin Ther Targets, 2009, 13(7): 785-794.

[9] Brunt KR, Fenrich KK, Kiani G,. Protection of human vascular smooth muscle cells from H2O2-induced apoptosis through functional codependence between HO-1 and AKT[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2006, 26(9): 2027-2034.

[10] Levonen AL, Inkala M, Heikura T,. Nrf2 gene transfer induces antioxidant enzymes and suppresses smooth muscle cell growthand reduces oxidative stress in rabbit aorta[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2007, 27(4): 741-747.

[11] Kim SE, Lee MY, Lim SC,. Role of Pin1 in neointima formation: down-regulation of Nrf2-dependent heme oxygenase-1 expression by Pin1[J]. Free Radic Biol Med, 2010, 48(12): 1644-1653.

（編輯: 周宇紅）

Effects of activation of nuclear factor-erythroid 2-related factor 2 on oxidative stress-induced injury of vascular smooth muscle cells in rat

FENG Jian, HE Guoxiang*, LIU Jianping, JING Tao

(Department of Cardiology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)

To investigate the effect of the activation of nuclear factor-erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) on the injury of rat vascular smooth muscle cells (VSMCs) induced by oxidative stress.Rat aortic VSMCs were cultured and divided into control group, oxidative damage group, Nrf2 activation group and Nrf2 siRNA-expressing lentiviral vector (Nrf2 siRNA) group. Protein level of Nrf2 was determined by Western blotting. Cell viability was measured by MTT assay, and cell apoptosis was determined by Hoechst 33342 and Annexin V/FITC.VSMCs were transiently transfected with Nrf2 siRNA. Nrf2 siRNA significantly inhibited the expression of Nrf2 at protein level compared to the control(＜0.05). Compared to oxidative damage group, cell viability was significantly increased (＜0.05) and cell apoptosis was decreased in Nrf2 activation group(＜0.05). However, compared to oxidative damage group, cell viability was significantly decreased (＜0.05) and cell apoptosis was increased in Nrf2 siRNA group(＜0.05).Nrf2 activation can reduce oxidative stress-induced damage inVSMCs.

nuclear factor-erythroid 2-related factor 2; oxidative stress; vascular smooth muscle cells

R543

A

10.3724/SP.J.1264.2013.00058

2012-12-10;

2012-12-31

馮 建, 現(xiàn)在四川省瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科工作

何國祥, Tel: 023-68754268, E-mail: yyxnk@yahoo.com.cn