干擾素-α對人血管成纖維細(xì)胞遷移的影響

吳 強(qiáng), 黃 晶, 宋 方, 龍向淑

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干擾素-α對人血管成纖維細(xì)胞遷移的影響

吳 強(qiáng)*, 黃 晶, 宋 方, 龍向淑

（貴州省人民醫(yī)院心內(nèi)科, 貴陽 550002）

探討干擾素-α（IFN-α）對人腦血管外膜成纖維細(xì)胞（VAFs）遷移的影響及機(jī)制。培養(yǎng)人腦VAFs，用終濃度為2000kU/L的IFN-α刺激24h（IFN-α組），用細(xì)胞劃線法與Tanswell法檢測細(xì)胞遷移能力變化，用Real-time PCR法和蛋白免疫印跡（Western blotting）法分別檢測細(xì)胞中干擾素誘導(dǎo)蛋白16在mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化。以空白組為對照。與空白組比較，IFN-α組VAFs的干擾素誘導(dǎo)蛋白16的mRNA和蛋白表達(dá)水平上調(diào)，細(xì)胞遷移受限。IFN-α可抑制VAFs遷移，該效應(yīng)可能與促進(jìn)干擾素誘導(dǎo)蛋白16表達(dá)有關(guān)。

干擾素α; 成纖維細(xì)胞; 遷移; 干擾素誘導(dǎo)蛋白

血管外膜成纖維細(xì)胞（vascular adventitial fibroblasts，VAFs）是動脈管壁成分細(xì)胞之一，近年研究發(fā)現(xiàn)VAFs的增殖、表型轉(zhuǎn)化、遷移及分泌細(xì)胞外基質(zhì)等變化參與了血管增殖性疾病的病理改變，在血管重構(gòu)過程中起著重要的作用[1-3]。干擾素（interferon，IFN）是一組具有抗病毒、抗增殖、影響細(xì)胞生長和分化等作用的細(xì)胞因子，通過誘導(dǎo)表達(dá)多種IFN誘導(dǎo)蛋白發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)[4]。本文應(yīng)用IFN-α刺激人腦VAFs，檢測其遷移和IFN誘導(dǎo)蛋白16（intreferon-inducible protein，IFI16）表達(dá)的變化，旨在探討IFN-α對VAFs遷移的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人腦VAFs細(xì)胞株購自ScienCell公司；IFN-α購自北京三元基因工程有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司；人IFI16引物（上游：gaagtgccagcgtaactccta，下游：tacctcaaacaccccattcac，80bp）和人β-actin引物（上游：tggcaccacaccttctacaatg，下游：tcatcttctcgcggttggc，103bp）購自上海生工生物工程公司；Real-time PCR熒光染料試劑盒購自TakaRa公司；Transwell小室購自Corning公司。

1.2 VAFs的培養(yǎng)

將凍存的VAFs復(fù)蘇后移入15ml離心管，加入10倍體積的10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，1000r/min離心5min，棄上清，加入1ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，移至培養(yǎng)瓶中，再加培養(yǎng)基至4ml，置于5%CO2培養(yǎng)箱37℃孵育，24h后更換培養(yǎng)基。取復(fù)蘇后第3～4代生長狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗。

1.3 實(shí)驗分組

空白組：加入10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h；IFN-α處理組：加入含IFN-α終濃度為 2000kU/L的10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。

1.4 Real-time PCR法檢測IFI16的mRNA表達(dá)

取對數(shù)生長期細(xì)胞，按Trizol法提取總RNA，測定RNA濃度和260nm/280nm值，按RT-PCR兩步法試劑盒說明操作逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA（42℃×60min，70℃×5 min）。按照熒光PCR試劑盒說明操作進(jìn)行PCR擴(kuò)增。Real-time PCR采用Step One PlusTM系統(tǒng)，條件：95℃30s預(yù)變性，95℃5s，60℃ 34s，重復(fù)循環(huán)40次。溶解曲線分析95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s。根據(jù)△Ct和2—△Ct計算各組IFI16 mRNA的相對表達(dá)量。實(shí)驗重復(fù)3次。

1.5 Western 免疫印跡法檢測蛋白表達(dá)

按細(xì)胞裂解液說明書提取細(xì)胞蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，置沸水煮5min變性；10%分離膠電泳，電壓80V，進(jìn)入濃縮膠后改為120V。濕電轉(zhuǎn)膜，電流200mA，轉(zhuǎn)膜時間1h；5%脫脂奶粉室溫封閉1h；TBST洗膜3次，每次10min；一抗4℃（IFI16抗體和β-actin抗體稀釋度分別為1∶500和1∶5000）過夜孵育；TBST洗膜3次，每次10min；37℃孵育二抗1h；TBST洗膜3次，每次10min；加入ECL反應(yīng)印跡。用掃描儀掃描曝光膠片，Bandscan4.3軟件進(jìn)行總灰度分析。以β-actin為內(nèi)對照測定各組IFI16蛋白的相對含量。實(shí)驗重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞劃線法觀察細(xì)胞遷移

在孔內(nèi)細(xì)胞匯合度＞90%時，垂直于孔背面的橫線劃痕標(biāo)記，分別于空白組和IFN-α組對應(yīng)的各孔內(nèi)加入不含和含IFN-α終濃度為2000kU/L的5%血清DMEM培養(yǎng)基1ml，置于5%CO2培養(yǎng)箱，于37℃孵育24h后隨機(jī)選取視野拍照。

1.7 Transwell小室法定量遷移細(xì)胞

取對數(shù)生長期細(xì)胞，消化、計數(shù)后，用0.1%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至1×105個/mL。在每個小室中加入100μl細(xì)胞懸液，在24孔板下室內(nèi)加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基800μl（空白組）；另于上、下室內(nèi)加入終濃度為2000kU/L的IFN-α（IFN-α組）。將24孔板置于5%CO2培養(yǎng)箱，于37℃孵育24h后棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，上室用PBS液洗滌3遍，將小室置于4%多聚甲醛中固定20min，自然晾干。將小室置于0.1%結(jié)晶紫中染色20min后，用滅菌水洗滌3遍。再度置干后，顯微鏡下隨機(jī)選取4個視野（400×），計數(shù)遷移細(xì)胞。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 IFI16的mRNA與蛋白表達(dá)的變化

與空白組比較，IFN-α組IFI16的mRNA與蛋白表達(dá)上調(diào)（＜0.05；圖1，表1）。

2.2 VAFs遷移的變化

細(xì)胞劃線法發(fā)現(xiàn)，低血清培養(yǎng)24h后IFN-α組的細(xì)胞遷移范圍低于空白組（圖2A，B，C，D）。Transwell小室遷移細(xì)胞計數(shù)結(jié)果顯示，IFN-α組的遷移細(xì)胞數(shù)低于空白組（＜0.05；表1，圖2E，F(xiàn)，G，H）。

圖1 空白組和IFN-α組的IFI16蛋白表達(dá)的變化

Figure 1 The expression of IFI16 protein in blank control group and IFN-α group

3 討 論

血管壁是由內(nèi)、中及外膜組成，相應(yīng)地其細(xì)胞成分分別為血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及VAFs。長期以來關(guān)于動脈粥樣硬化、高血壓、血管介入治療后再狹窄等血管增殖性疾病的研究主要集中于前二者，而VAFs被認(rèn)為僅具有支持和營養(yǎng)功能。近年來越來越多的證據(jù)[1-3]顯示，VAFs增殖、表型轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞，并向內(nèi)膜遷移與分泌膠原纖維等生物學(xué)行為異常也是血管重構(gòu)發(fā)生、發(fā)展的重要病理生理機(jī)制之一。

表1 空白組和IFN-α組的IFI16的mRNA與蛋白表達(dá)、細(xì)胞遷移數(shù)的變化

注: 與空白組比較,P＜0.05

圖2 空白組和IFN-α組VAFs遷移范圍的變化

Figure 2 VAFs migration capability of blank control group and IFN-α group(crystal violet)

A: 空白組; B: IFN-α組加入IFN-Α即刻; C: 空白組24h; D: IFN-α組加入IFN-α23h; E: 空白組24h結(jié)晶紫染色（×100）; F: IFN-α組24h結(jié)晶紫染色（×100）; G: 空白組24h結(jié)晶紫染色（×400）; H: IFN-α組24h結(jié)晶紫染色（×400）

IFN是機(jī)體在病毒及其他IFN誘導(dǎo)劑刺激下，由單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及體細(xì)胞所產(chǎn)生的一類具有抗增殖、抗病毒、調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和免疫應(yīng)答等多種生物活性的糖蛋白，根據(jù)其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體復(fù)合物的不同以及序列同源性，被分為Ⅰ型（包括IFN-α、IFN-β、IFN-δ及IFN-τ等）[5]、Ⅱ型（IFN-γ）[6]及Ⅲ型（IFN-λ）[7]。近年來，針對IFN對血管重構(gòu)的影響已取得了一些有趣的證據(jù)。局部轉(zhuǎn)染過表達(dá)IFN-β能夠顯著下調(diào)球囊損傷動脈后的血管平滑肌細(xì)胞增殖和血管新生內(nèi)膜形成[8]；然而，轉(zhuǎn)染IFN-γ受體α亞單位的可溶性突變體以抑制內(nèi)源性IFN-γ的作用，可抑制血管球囊損傷后的血管平滑肌細(xì)胞增殖和血管內(nèi)皮修復(fù)，提示IFN-γ具有促進(jìn)增殖性血管重構(gòu)的作用[9]。這些看似矛盾的實(shí)驗結(jié)果可能與不同的IFN所觸發(fā)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路間的差異有關(guān)，這也反映了IFN功能的多樣性。本研究結(jié)果顯示，在無相關(guān)病理因素刺激下，離體培養(yǎng)的VAFs亦存在一定的遷移活性，而IFN-α可抑制VAFs遷移范圍，下調(diào)遷移細(xì)胞數(shù)量。

IFI16是IFN誘導(dǎo)蛋白200家族的人類同源成員之一，通過與轉(zhuǎn)錄因子Rb和p53等下游目標(biāo)蛋白的結(jié)合，介導(dǎo)IFN發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)[10-12]。有研究發(fā)現(xiàn)IFI16具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及新生血管形成的作用[13]，參與對血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)的調(diào)控[14]，但尚未明了IFI16在VAFs遷移過程中所扮演的角色。本研究結(jié)果顯示，IFN-α組IFI16的mRNA與蛋白表達(dá)明顯高于空白組，表明IFN-α可誘導(dǎo)VAFs的IFI16過表達(dá)，IFI16可能參與了IFN-α對VAFs遷移的調(diào)控。當(dāng)然這個結(jié)論尚需要進(jìn)一步進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染過表達(dá)IFI16和（或）沉默其表達(dá)以確認(rèn)，從而為IFN及其誘導(dǎo)蛋白應(yīng)用于血管增殖性疾病的干預(yù)提供理論依據(jù)。

[1] An SJ, Boyd R, Zhu M,. NADPH oxidase mediates angiotensin II-induced endothelin-1 expression in vascular adventitial fibroblasts[J]. Cardiovasc Res, 2007, 75(4): 702-709.

[2] Chiang HY, Korshunov VA, Serour A,. Fibronectin is an important regulator of flow-induced vascular remodeling[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2009, 29(7): 1074-1079.

[3] Tieu BC, Ju X, Lee C,. Aortic adventitial fibroblasts participate in angiotensin-induced vascular wall inflammation and remodeling[J]. J Vasc Res, 2011, 48(3): 261-272.

[4] Wessely R. Interference by interferons: Janus faces in vascular proliferative diseases[J]. Cardiovasc Res, 2005, 66(3): 433-443.

[5] Pitha PM, Kunzi MS. Type I interferon: the ever unfolding story[J]. Curr Top Microbiol Immunol, 2007, 316: 41-70.

[6] van Boxel-Dezaire AH, Stark GR. Cell type-specific signaling in response to interferon-gamma[J]. Curr Top Microbiol Immunol, 2007, 316: 119-154.

[7] Ank N, West H, Bartholdy C,. Lambda interferon (IFN-lambda), a type III IFN, is induced by viruses and IFNs and displays potent antiviral activity against select virus infections[J]. J Virol, 2006, 80(9): 4501-4509.

[8] Stephan D, San H, Yang ZY,. Inhibition of vascular smooth muscle cell proliferation and intimal hyperplasia by gene transfer of beta-interferon[J]. Mol Med, 1997, 3(9): 593-599.

[9] Kusaba K, Kai H, Koga M,. Inhibition of intrinsic interferon-gamma function prevents neointima formation after balloon injury[J]. Hypertension, 2007, 49(4): 909-915.

[10] Asefa B, Klarmann KD, Copeland NG,. The interferon-inducible p200 family of proteins: a perspective on their roles in cell cycle regulation and differentiation[J]. Blood Cells Mol Dis, 2004, 32(1): 155-167.

[11] Liao JC, Lam R, Brazda V,. Interferon-inducible protein 16: insight into the interaction with tumor suppressor p53[J]. Structure, 2011, 19(3): 418-429.

[12] Kondo Y, Nagai K, Nakahata S,. Overexpression of the DNA sensor proteins, absent in melanoma 2 and interferon-inducible 16, contributes to tumorigenesis of oral squamous cell carcinoma with p53 inactivation[J]. Cancer Sci, 2012, 103(4): 782-790.

[13] Raffaella R, Gioia D, De Andrea M,. The interferon-inducible IFI16 gene inhibits tube morphogenesis and proliferation of primary, but not HPV16 E6/E7-immortalized human endothelial cells[J]. Exp Cell Res, 2004, 293(2): 331-345.

[14] Caposio P, Gugliesi F, Zannetti C,. A novel role of the interferon-inducible protein IFI16 as inducer of proinflammatory molecules in endothelial cells[J]. J Biol Chem, 2007, 282(46): 33515-33529.

（編輯: 周宇紅）

Interferon-α suppresses migration of human brain vascular adventitial fibroblasts

WU Qiang*, HUANG Jing, SONG Fang, LONG Xiangshu

(Department of Cardiology, Guizhou Provincial Peoples’ Hospital, Guiyang 550002, China)

To investigate the effect of interferon-α (IFN-α) on the migration of human brain vascular adventitial fibroblasts (VAFs).VAFs were cultured in presence or absence of 2000 kU/L IFN-α for 24h. VAFs migration was investigated by cell scratch assay and counted by Transwell chamber test. The mRNA and protein expression of intreferon-inducible protein 16 were detected by semiquantitative RT-PCR and Western blotting.IFN-α treatment resulted in a reduce in cell migration and enhanced expression of intreferon-inducible protein 16 at mRNA and protein levels in VAFs.IFN-α may inhibit the migration capacity of VAFsup-regulating the expression of intreferon-inducible protein 16.

interferon alfa; fibroblasts; migration; intreferon-inducible protein

(2009-30)(TZJF-2010-098)(No.81260030)

R363

A

10.3724/SP.J.1264.2013.00057

2012-12-10;

2013-01-06

貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長專項資金資助項目（黔省專合字2009-30）; 貴州省高層次人才科研條件特助經(jīng)費(fèi)項目（TZJF-2010-098）; 國家自然科學(xué)基金資助項目（No.81260030）

吳 強(qiáng), Tel: 0851-5937194, E-mail: waqqaa@yahoo.com.cn