高效酒精酵母菌選育及其特性研究

羅躍中，李忠英，李繼睿，吳永堯

（1.湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 株洲 412004；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)院，湖南 長沙 410128）

隨著全球石油能源的日趨枯竭及環(huán)境污染的加劇，開發(fā)新的綠色能源勢在必行，燃料酒精替代汽油能源將逐漸成為發(fā)展趨勢[1-2]。目前，燃料酒精生產(chǎn)多采用微生物發(fā)酵方式。生產(chǎn)酒精的菌種以酵母菌為主，酒精酵母的優(yōu)劣不僅直接影響發(fā)酵率的高低，而且會(huì)影響酒精的產(chǎn)量和品質(zhì)。在酒精發(fā)酵時(shí)，產(chǎn)生的高濃度酒精和相對較高的發(fā)酵溫度對產(chǎn)酒率影響較大，高濃度酒精會(huì)限制酵母菌的生長繁殖，對酒精發(fā)酵產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制作用；與此同時(shí)，受季節(jié)變化和發(fā)酵過程放熱使溫度不斷升高也會(huì)限制酵母的發(fā)酵。酵母發(fā)酵適宜溫度是30℃～33℃，一般不超過36℃，溫度過高，會(huì)導(dǎo)致酵母老化和死亡，使發(fā)酵過程不能正常進(jìn)行，酒精得率降低。而耐高溫酵母能減少生產(chǎn)中由于降溫所帶來的麻煩和費(fèi)用。因此，高產(chǎn)酒精酵母的選育和發(fā)酵工藝的改進(jìn)是實(shí)現(xiàn)酒精濃醪發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵[3-6]。

本研究從自然界中篩選分離出具有較強(qiáng)溫度和酒精耐受性的酵母菌株，經(jīng)紫外線和亞硝酸誘變得到一株高產(chǎn)突變株UV-N-5，提高了其產(chǎn)酒精能力，同時(shí)也對其生理特性進(jìn)行研究，旨在篩選培育適用于酒精工業(yè)發(fā)酵的新菌種。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌樣來源

各種腐敗水果、葡萄園里土壤、湘天橋菜市場甜酒醪、湘鄉(xiāng)燕京啤酒廠酒醪、學(xué)生食堂下污水及實(shí)驗(yàn)室教學(xué)用酵母菌等。

1.1.2 主要培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：含10%vol酒精麥芽汁（8°Bx）、含14%vol酒精麥芽汁（10°Bx）。

分離馴化培養(yǎng)基：麥芽汁（8°Bx）及酵母蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基（YPD）：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，若制備YPD固體培養(yǎng)基，加入2%瓊脂粉。

篩選培養(yǎng)基：TTC上層培養(yǎng)基為TTC 0.05g，葡萄糖0.5g，水1L；TTC下層培養(yǎng)基為YPD瓊脂。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖1.0g/L，KCl1.5g/L，酵母浸膏2.5g/L，醋酸鈉8.0g/L。

酒精發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5g/L，玉米漿20g/L，尿素2g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；XB124-S電子天平：梅特勒電子儀器有限公司；超凈工作臺：江蘇凈化設(shè)備廠；BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械；HPS-250生化培養(yǎng)箱：哈爾濱市東明科技有限公司；QYC-21全溫空氣搖床：上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；S2617R顯微鏡：江南光電股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

將采集的樣品加無菌水振蕩1h，打碎菌膠團(tuán)，釋放游離菌備用。

1.3.2 富集培養(yǎng)

在振蕩處理后的菌懸液中取5mL，分別加入至已滅菌的酒精度為10%vol的培養(yǎng)基中，40℃培養(yǎng)24h，再轉(zhuǎn)入酒精度為14%vol的培養(yǎng)基中，45℃培養(yǎng)24h，鏡檢。配制成合適的菌懸液并取lmL接入YPD固體平皿中，45℃培養(yǎng)2d～3d，經(jīng)鏡檢為純種后分別轉(zhuǎn)入YPD固體斜面，冰箱保存。

1.3.3 酵母菌的篩選

TTC法[7-8]：將分離得到的各菌株活化后依次接入TTC下層培養(yǎng)基的平皿中，培養(yǎng)24h，長出菌落后倒入TTC上層培養(yǎng)基，40℃保溫（陰暗處）2h～3h，成深紅色菌落，將酵母菌接種于YPD固體培養(yǎng)基中，長出菌落后再接種于麥芽汁培養(yǎng)基中增菌使活菌濃度達(dá)到107個(gè)/mL，然后取6mL裝入300mL帶濾芯的發(fā)酵瓶中，加入200mL麥芽汁于40℃培養(yǎng)48h，每日稱重，記錄每日失重情況，待發(fā)酵結(jié)束時(shí)計(jì)算總失重，并對發(fā)酵液成分進(jìn)行分析（可溶性固形物、酒精度、還原糖）。試驗(yàn)重復(fù)3次，復(fù)篩得到性狀最為優(yōu)良的菌株。

1.3.4 紫外線及亞硝酸復(fù)合誘變方法

參照劉慶玉等[9]實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行，菌懸液先用30W紫外線照射處理60s，然后再用濃度為0.2mol/L的亞硝酸處理20min，誘變菌株經(jīng)培養(yǎng)后，挑取菌落較大且厚的菌株，編號并接入試管斜面保藏，同時(shí)取對應(yīng)的菌株活化后接種至250mL搖瓶中，30℃、180r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)48h，對發(fā)酵液進(jìn)行分析并選取優(yōu)勢菌株。

1.3.5 還原糖的測定

采用DNS法測定[10]。

1.3.6 酒精度的測定

取100mL成熟發(fā)酵醪，加入100mL蒸餾水，蒸餾出100mL液體，搖勻后用酒精計(jì)和溫度計(jì)分別測定其酒精度和溫度，然后查表校正為20℃時(shí)的酒精度[11]。

1.3.7 優(yōu)勢菌株生理特性研究

生長曲線的測定：將篩選出的酵母接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基中，在一定溫度條件下180r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)，每隔2h取一次樣。用分光光度計(jì)在波長660nm處，以蒸餾水作空白，測定培養(yǎng)液的OD值。

耐酒精特性：杜氏小管注滿培養(yǎng)基后倒置于盛滿麥芽汁的試管中。滅菌后加入不等量的無水乙醇，制成不同的濃度梯度，接種待測菌株于30℃的條件下培養(yǎng)。10h后測定細(xì)胞死亡率。

耐酸堿特性：將酵母種子液接入不同pH值的YPD培養(yǎng)基中，最適生長溫度條件下恒溫培養(yǎng)24h，于波長660nm處測定OD值，確定在不同pH值下的生長情況。

耐高溫特性：將酵母種子液接入YPD培養(yǎng)基中，不同溫度恒溫培養(yǎng)24h，于波長660nm處測定OD值，確定在不同溫度條件下的生長情況。

耐糖性：制備葡萄糖含量分別為10%、20%、35%、40%、50%、60%（w/v）的麥芽汁，滅菌后分別接種酵母菌，35℃培養(yǎng)24h，于波長660nm處測定OD值，判斷菌株對滲透壓的耐受性。

遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：對經(jīng)過紫外線和亞硝酸誘變篩選出的產(chǎn)酒精能力最高的優(yōu)勢菌株，進(jìn)行連續(xù)5代傳代培養(yǎng)后測定其產(chǎn)酒率，考察優(yōu)勢菌株的遺傳穩(wěn)定性。

2 結(jié)果分析

2.1 酵母菌的篩選

本實(shí)驗(yàn)將采集的樣品置于含10%vol乙醇的培養(yǎng)基中，使在含高濃度酒精培養(yǎng)基條件下不生長的菌株被淘汰掉，而能適應(yīng)的菌株被保留下來，富集及馴化培養(yǎng)的主要目的是使目標(biāo)菌株能夠適應(yīng)其生長環(huán)境并旺盛生長。TTC是一種顯色劑，對酵母的代謝產(chǎn)物發(fā)生呈色反應(yīng)，通過其可以判斷酵母中呼吸酶活力的大小，即酵母產(chǎn)酒精能力的高低[12]。顏色深的菌株呼吸酶活力強(qiáng)，有較強(qiáng)的產(chǎn)酒精能力。經(jīng)過篩選共得到8株產(chǎn)氣較高酵母菌，結(jié)果見表1。

表1 TTC篩選酵母結(jié)果Table 1 Results of yeast screened by TTC

由表1可看出，TJ-18號酵母產(chǎn)酒精能力較強(qiáng)，達(dá)到5.90%vol；殘還原糖約為1.00%，糖利用率較高，且發(fā)酵力突出，培養(yǎng)48h，CO2失重為10.4g。故將TJ-18菌作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)初始菌株。

2.2 紫外線誘變篩選結(jié)果

按1.3.4實(shí)驗(yàn)方法，菌懸液先用30W紫外線照射處理60s，培養(yǎng)后選取大且厚菌落，分別標(biāo)識為UV1～UV10，并同時(shí)接種及發(fā)酵培養(yǎng)。紫外誘變的結(jié)果（表2）可知，經(jīng)過誘變后，UV-1、UV-6產(chǎn)酒精能力有所減弱，而其他大部分菌株的產(chǎn)酒精能力得到了提升，如UV-2、UV-8、UV-10等菌株酒精產(chǎn)量達(dá)到7.00%vol左右，其中UV-8菌株產(chǎn)量最高，達(dá)到7.02%vol，相對于出發(fā)菌株TJ-18提高了19.0%。紫外線是常用的物理誘變因子，是誘發(fā)微生物突變的一種非常有用的工具。UV誘變主要是通過使DNA分子形成嘧啶二聚體，影響堿基配對與正常解鏈，造成基因的突變或死亡，從而提高產(chǎn)酒精能力[13]。

表2 TJ-18菌株紫外誘變后結(jié)果Table 2 Results of ultraviolet mutation of TJ-18 strain

2.3 亞硝酸誘變篩選結(jié)果

對菌株UV-8再進(jìn)行亞硝酸誘變處理，由表3可知，經(jīng)亞硝酸誘變后，酒精的產(chǎn)量進(jìn)一步提高，主要是紫外線與亞硝酸有較好的協(xié)同性。其中菌株UV-N-5的酒精度為8.25%vol，相對于UV-8提高了17.5%，即為本實(shí)驗(yàn)得到的目的菌株。

表3 UV-8菌株經(jīng)亞硝酸誘變后結(jié)果Table 3 Results of nitrite mutation of UV-8 strain

2.4 優(yōu)勢菌株UV-N-5的生理特性研究

2.4.1 生長曲線的測定

通過微生物生長曲線可以了解優(yōu)勢降解菌UV-N-5生長繁殖規(guī)律。其反映了單細(xì)胞微生物在一定環(huán)境條件下于液體培養(yǎng)時(shí)所表現(xiàn)出的群體生長規(guī)律，對于科研和生產(chǎn)都具有重要的指導(dǎo)意義。從圖1可以看出，在0～2h沒有表現(xiàn)出明顯的停滯期，各個(gè)溫度下都有不同程度的生長。從4h～10h進(jìn)入對數(shù)生長期，12h后達(dá)到穩(wěn)定期。

圖1 菌種UV-N-5生長曲線Fig.1 Growth curve of strain UV-N-5

2.4.2 耐酒精特性

過高的酒精濃度對酵母有毒性，會(huì)抑制細(xì)胞的生長及發(fā)酵活性。所以，酵母的發(fā)酵能力在很大程度上取決于其自身酒精耐受力的大小[14]。酵母菌UV-N-5在麥芽汁中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30℃，接種量為1×107個(gè)/L，培養(yǎng)時(shí)間為10h，測定菌株的死亡率。由圖2可知，在酒精度為20%vol、16%vol、12%vol時(shí)，UV-N-5的死亡率分別為50%、43%和34%。在酒精度為8%vol、4%vol，死亡率分別為11%和6%。說明UV-8能耐較高濃度的酒精?？赡芘c其從甜酒糟中篩選出來的有關(guān)，這一點(diǎn)從生產(chǎn)上來說是有利的。

圖2 菌種UV-N-5耐酒精特性Fig.2 Alcohol resistant characteristics of strain UV-N-5

2.4.3 耐酸堿特性

圖3 菌株UV-N-5耐酸堿特性Fig.3 Acid and alkali resistant characteristics of strain UV-N-5

耐酸堿實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3）表明，UV-N-5菌能在pH值為3.0～9.0的范圍內(nèi)正常生長，在pH值為4.5～6.0的范圍內(nèi)生長旺盛，而這也正是實(shí)際生產(chǎn)中的正常pH值范圍，說明了UV-N-5菌可用于實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用。

2.4.4 耐高溫特性

菌株UV-N-5耐高溫實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4）可知，當(dāng)發(fā)酵溫度達(dá)到35℃時(shí)，該菌的生長狀態(tài)達(dá)到最佳，之后隨著溫度的升高而降低。但是該菌在溫度40℃時(shí)仍保持出很好的耐受性，說明本實(shí)驗(yàn)篩選出的酵母菌的耐熱性憂于之前篩出的菌株。但發(fā)酵溫度高于40℃時(shí)，該菌的發(fā)酵力顯著下降，可能是因?yàn)楦邷厥辜?xì)胞內(nèi)酶活降低，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和流動(dòng)性發(fā)生變化，引起酵母早衰、死亡，故高溫對酵母菌的生長和發(fā)酵產(chǎn)氣是不利的[15]。

圖4 菌株UV-N-5耐溫特性Fig.4 Temperature resistance characteristic of strain UV-N-5

2.4.5 不同糖質(zhì)量濃度對UV-N-5生長影響

菌株UV-N-5在不同糖質(zhì)量濃度中生長情況見圖5，UVN-5在低濃度的葡萄糖中都能較好生長，當(dāng)糖質(zhì)量濃度＞10%，酵母菌的生長明顯受到抑制，隨糖質(zhì)量濃度的增加而抑制酵母菌的增殖。這可能是由于糖質(zhì)量濃度過高造成滲透壓的增大抑制了酵母菌的增殖。而提高初始糖質(zhì)量濃度可以提高發(fā)酵醪的酒精含量，因此生產(chǎn)用的母菌都需要有一定的滲透壓的耐受能力。從圖5可以看出，當(dāng)初始糖質(zhì)量濃度達(dá)到40%時(shí)，UV-N-5菌的生長變得緩慢。

圖5 不同糖質(zhì)量濃度對菌種UV-N-5生長影響Fig.5 Effect of different sugar concentration on strain UV-N-5 growth

2.4.6 菌株UV-N-5傳代穩(wěn)定性研究

對優(yōu)勢菌株UV-N-5進(jìn)行連續(xù)5次傳代實(shí)驗(yàn)，測定其產(chǎn)酒精能力，由表4可知，發(fā)酵后平均產(chǎn)酒精度維持在8.20%vol左右。表現(xiàn)出較好的傳代穩(wěn)定性。

表4 菌株UV-N-5傳代穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of strain UV-N-5 genetic stability test

3 結(jié)論

本研究從自然界中分離得到的一株優(yōu)良的酒精生產(chǎn)菌株TJ-18，發(fā)酵酒精度達(dá)到5.90%vol，表現(xiàn)出較強(qiáng)的發(fā)酵產(chǎn)酒精能力。通過紫外誘變對其進(jìn)行了改造，其中UV-8菌株產(chǎn)酒精量最高，達(dá)到7.02%vol，相對于出發(fā)菌株TJ-18提高19.0%。再以UV-8菌株為出發(fā)菌株，經(jīng)亞硝酸誘變后發(fā)酵能力進(jìn)一步提高。使其發(fā)酵后的酒精度達(dá)到了8.25%vol，比初始菌株TJ-18提高39.83%。同時(shí)對優(yōu)勢菌株UV-N-5進(jìn)行5次傳代實(shí)驗(yàn)，其產(chǎn)酒精相對穩(wěn)定，說明其遺傳穩(wěn)定性較好。

微生物菌種質(zhì)量的好壞對發(fā)酵工業(yè)有及其重要的影響，這一研究的技術(shù)關(guān)鍵在于獲得耐高滲透壓且酒精發(fā)酵速率快、耐酒精和耐高溫的酵母菌種，這也是目前研究熱點(diǎn)。通過對復(fù)合誘變篩選后UV-N-5菌的生理特性研究，發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)過程中該菌表現(xiàn)出較好的耐高溫、耐糖性及耐酒精特性，但是對具體適合該菌株的培養(yǎng)基質(zhì)和培養(yǎng)條件有待在后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究，為其以后作為工業(yè)菌應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

[1]劉 暢，王 濤，石翠芳.耐高溫酵母菌的篩選及特性研究[J].釀酒，2007，34（2）：52-53.

[2]劉海臣，張敏楠，阮時(shí)雷，等.多樣品耐高溫產(chǎn)乙醇酵母的篩選及生長特性研究[J].食品科技，2008（3）：18-19.

[3]陳思耘，蕭熙佩.酵母生物化學(xué)[M].濟(jì)南：山東科學(xué)技術(shù)出版社，1990.

[4]秦成國.玉米粉高濃度酒精發(fā)酵的研究[J].釀酒科技，1997（4）：52-54.

[5]毛志群，張 偉，檀建新，等.燃料乙醇用高產(chǎn)酒精酵母的篩選及鑒定[J].釀酒，2003，30（3）：35-36.

[6]KREGER NYW.The yeasts:A taxonomic study[M].Third revised and enlarged edition.Netherlands:Elsevier sciencepublishers B.V.，1984.

[7]中國科學(xué)院微生物研究所.常見與常用真菌[M].北京：科學(xué)出版社，1973.

[8]王 梅，張澎湃，帥桂蘭，等.TTC 在黃酒酵母選育中的應(yīng)用[J].釀酒，2001，28（5）：62-64.

[9]劉慶玉，姚 影，張 敏，等.紫外誘變篩選高效木質(zhì)素降解菌株的研究[J].可再生能源，2010，8（28）：58-59.

[10]許安邦，林 維.食品分析[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2002.

[11]章克昌.酒精與蒸餾酒工藝學(xué)[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2004.

[12]董博宇，陳葉福，岳瑞雪，等.TTC 在發(fā)酵木糖高產(chǎn)乙醇的休哈塔假絲酵母選育中的應(yīng)用[J].釀酒科技，2008（10）：40-43.

[13]周德慶.微生物學(xué)教程[M].北京：高等教育出版社，2002.

[14]楊東升，朱麗元，謝曉紅，等.UV 處理篩選耐高濃度乙醇釀酒酵母菌株[J].中國釀造，2010，29（10）：35-38.

[15]苑 偉，王學(xué)峰，劉延琳.優(yōu)選釀酒酵母菌株發(fā)酵性能研究[J].中國釀造，2010，29（9）：52-56.