棉花枯萎病菌產(chǎn)角質(zhì)酶的連續(xù)誘導(dǎo)

冉琴琴，張效寧，張文坤，張學(xué)俊，2*

（1.貴州大學(xué) 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽 550003；2.貴州大學(xué) 化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，貴州 貴陽 550003）

角質(zhì)酶（Cutinase，EC3.1.1.74）是一種多功能酶，具有屬于α/β水解酶折疊的共同結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)[1]，是絲氨酸水解酶家族中較小的成員[2]，可以降解角質(zhì)產(chǎn)生脂肪酸[3]，也可以水解甘油三酯等化合物[4]。角質(zhì)酶能夠水解短鏈或長鏈酯類，角質(zhì)酶除了能參與水解反應(yīng)，也能參與酯化反應(yīng)[5]，能夠催化酸與醇的酯化、脂肪酸鹽與醇的轉(zhuǎn)酯化等反應(yīng)，所以角質(zhì)酶在生物催化[6]、農(nóng)業(yè)化學(xué)品工業(yè)[7]、農(nóng)產(chǎn)品深加工[8]、護(hù)理用品行業(yè)[9]、生物降解及廢水處理[10]、紡織工業(yè)[11]等方面有著廣泛的應(yīng)用，重要的是其還可以用作酯轉(zhuǎn)換制備生物柴油?，F(xiàn)在，對(duì)產(chǎn)角質(zhì)酶的菌株的研究引起了廣大科學(xué)工作者廣泛的興趣，研究主要有產(chǎn)酶菌株篩選、角質(zhì)酶菌株的誘導(dǎo)和誘變過程表達(dá)、發(fā)酵條件優(yōu)化、角質(zhì)酶結(jié)構(gòu)和酶特性、基因重組改良過表達(dá)等方面的內(nèi)容[12]。

人們是在研究植物病菌治病機(jī)理時(shí)發(fā)現(xiàn)角質(zhì)酶的，角質(zhì)層生長在植物表面對(duì)植物組織起到保護(hù)作用，當(dāng)致病菌在入侵植物時(shí)，必須分泌出的角質(zhì)酶降解角質(zhì)層，破壞角質(zhì)層后方可侵入到植物內(nèi)部利用植物組織營養(yǎng)進(jìn)一步繁殖。在自然界中，角質(zhì)酶的主要來源有2個(gè)方面：微生物和花粉[13]。目前，國內(nèi)外眾多學(xué)者對(duì)角質(zhì)酶的研究，主要集中在真菌角質(zhì)酶和細(xì)菌角質(zhì)酶。

角質(zhì)酶是誘導(dǎo)酶，只有在角質(zhì)存在條件下激活真菌內(nèi)的角質(zhì)酶基因，誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄表達(dá)角質(zhì)酶。DAVIES KA等[14]的研究指出，未經(jīng)過角質(zhì)誘導(dǎo)的真菌，其基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的角質(zhì)酶量非常少，但加入角質(zhì)時(shí)會(huì)誘導(dǎo)真菌的角質(zhì)酶基因，使角質(zhì)酶轉(zhuǎn)錄量大大增加。另一方面，分子生物學(xué)的方法也可以提高真菌產(chǎn)對(duì)角質(zhì)酶的過表達(dá)，張芙華等[15]報(bào)道的重組Bacillus subtilisWSHB06-07菌株的角質(zhì)酶產(chǎn)量可達(dá)168.8U/mL。誘導(dǎo)法和分子生物學(xué)方法相比之下，分子生物學(xué)方法投資高很多、周期長、風(fēng)險(xiǎn)大，而誘導(dǎo)法同樣可獲得高表達(dá)角質(zhì)酶的菌株，方法更為簡便直接，低成本高效率。

本實(shí)驗(yàn)以植物病菌為對(duì)象，采用誘導(dǎo)法獲得高產(chǎn)角質(zhì)酶，因?yàn)樵擃惒【姆敝潮仨毥柚诮琴|(zhì)酶。棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum）是常見的產(chǎn)角質(zhì)酶的優(yōu)良菌株，在未添加角質(zhì)誘導(dǎo)時(shí)產(chǎn)酶量可以達(dá)到7.932U/mL，比一般的真菌產(chǎn)酶量高。該菌種可從棉花或其生長的土壤中分離是一種?；暂^強(qiáng)、寄主范圍較窄的病菌。本研究在對(duì)該菌株進(jìn)行生長和發(fā)酵產(chǎn)角質(zhì)酶的環(huán)境條件研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了添加角質(zhì)對(duì)該菌產(chǎn)酶能力的提高以及連續(xù)激活真菌的角質(zhì)酶基因，誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄表達(dá)的研究。研究表明，誘導(dǎo)作用可以顯著地提高角質(zhì)酶的產(chǎn)量，產(chǎn)酶量可比無誘導(dǎo)時(shí)提高至4倍。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum）：天津農(nóng)學(xué)院植保研究室提供。

對(duì)硝基苯丁酸酯（p-nitrophenyl butyrate，PNB）購自美國Sigma公司；NaNO3、K2HPO4、MgSO4、KCl、FeSO4·7H2O、瓊脂、葡萄糖等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基，將土豆洗凈去皮，再稱取200g馬鈴薯并切成小塊，加1000mL蒸餾水煮爛，用8層紗布過濾，補(bǔ)足水分至1000mL，加熱，加入17g瓊脂，繼續(xù)加熱攪拌混勻，待瓊脂溶解完后，加入20g葡萄糖，攪拌均勻，分裝試管或者錐形瓶，加塞、包扎，121℃滅菌20min左右后取出試管擺斜面或者搖勻，冷卻后貯存?zhèn)溆谩?/p>

土豆汁：200g土豆，在沸水中浸煮20min，過濾，濾液置于冰箱中，備用。

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基[16]：葡萄糖1.0g/L，NaNO30.6g/L，K2HPO40.6g/L，MgSO40.2g/L，KCl 0.2g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1g/L，角質(zhì)0.1%。

礦物質(zhì)培養(yǎng)基：NaNO30.6g/L，K2HPO40.6g/L，MgSO40.2g/L，KCl 0.2g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1g/L。

1.3 角質(zhì)的制備

采用蕃茄角質(zhì)為誘導(dǎo)角質(zhì)。蕃茄表面有韌性更強(qiáng)的角質(zhì)，且容易大量獲得。蕃茄角質(zhì)的制備：將蕃茄于沸水中煮5min，驟冷分離取皮，并將皮于草酸緩沖液（草酸4g/L、草酸銨16g/L，pH3.8）中煮沸1.5h，用蒸餾水洗凈皮上粘性物質(zhì)。于50℃干燥箱中烘干至質(zhì)量恒定，磨碎備用。

1.4 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：將儲(chǔ)于冰箱中的菌種接入斜面種子培養(yǎng)基上，在30℃培養(yǎng)48h，然后接種于裝有100mL液體PDA的250mL錐形瓶中，30℃、160r/min搖床培養(yǎng)36h。

發(fā)酵培養(yǎng)：將發(fā)酵培養(yǎng)基分裝于數(shù)個(gè)250mL錐形瓶中，每瓶裝100mL。取培養(yǎng)36h的種子培養(yǎng)液2mL，加入其中，30℃、160r/min搖床培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后將發(fā)酵液用12層紗布過濾，濾液再于4℃條件下5500r/min離心30min，上清即為粗酶液，用于酶活測(cè)定。

1.5 酶活測(cè)定

酶活測(cè)定[14]：以對(duì)硝基苯丁酸酯（PNB）為底物測(cè)定酶的活力。反應(yīng)體系為1.8mL，包括200μL的粗酶液、200μL 0.4%的Tritonx-100、1380μL 50mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）和20μL 1.76%的PNB溶液。于37℃反應(yīng)10min后，在波長405nm處測(cè)定吸光度值。酶活定義：在反應(yīng)條件下，將每毫升酶液每分鐘產(chǎn)生1μg的對(duì)硝基苯酚定義為1個(gè)酶活單位，U/mL。酶活計(jì)算公式：

式中：OD為吸光值；V為反應(yīng)體系的體積，1.8mL；Mr為產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚的分子量，139.11g/mol；ε為摩爾消光系數(shù)，6830L/（mol·cm）；λ為比色皿的光程，0.5cm；V1為酶液體積，200μL；T為反應(yīng)時(shí)間10min。

1.6 連續(xù)誘導(dǎo)馴化實(shí)驗(yàn)方法

連續(xù)誘導(dǎo)操作工藝流程：

逐漸降低培養(yǎng)基中土豆汁的含量，逐漸提高角質(zhì)的含量，形成培養(yǎng)基中碳源角質(zhì)與土豆汁之間的含量比值變化的梯度環(huán)境。使得棉花枯萎病菌（F.oxysporum）在該環(huán)境條件下，被迫分泌產(chǎn)生更多的角質(zhì)酶以適應(yīng)新的生長環(huán)境。這樣可以使得真菌的角質(zhì)酶基因一直處于亢奮的激活狀態(tài)，角質(zhì)酶基因的轉(zhuǎn)錄量維持在逐步升高的水平，角質(zhì)酶的產(chǎn)量也就隨之逐步升高。

發(fā)酵培養(yǎng)基中土豆汁的添加量分別為40mL、20mL、10mL、5mL，礦物質(zhì)溶液的添加量分別是60mL、80mL、90mL、95mL，而角質(zhì)的添加量分別為0.5g、0.8g、1.0g、1.5g。將棉花枯萎病菌接種于第一梯度培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6d后，接入下一梯度培養(yǎng)基中，依次作相同處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種接種種齡的確定

為了確定最佳接種時(shí)間，按照1.4所述的種子培養(yǎng)方法，分別培養(yǎng)12h、24h、36h、48h、60h、72h，培養(yǎng)液以5000r/min離心30min，傾去上清液，加入蒸餾水100mL，再離心。重復(fù)3次。傾去上清液，烘干至質(zhì)量恒定，稱質(zhì)量，得細(xì)胞干質(zhì)量與時(shí)間的關(guān)系見圖1。

圖1 時(shí)間對(duì)菌體生長的影響Fig.1 Effect of time on bacteria growth

由圖1可知，顯示了72h內(nèi)菌體生長的變化情況，由生物量變化可知，菌體培養(yǎng)至25h～50h時(shí)處于對(duì)數(shù)生長期，對(duì)數(shù)生長期時(shí)菌體以一個(gè)恒定的最大的比生長速度生長，細(xì)胞數(shù)量呈指數(shù)遞增，生長繁殖旺盛因此對(duì)數(shù)期可以獲得健壯且數(shù)量眾多的發(fā)酵種子。本實(shí)驗(yàn)選擇菌體培養(yǎng)36h的處于對(duì)數(shù)生長期的菌體接種。

2.2 發(fā)酵溫度及培養(yǎng)基初始pH值的確定

圖2 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)角質(zhì)酶的影響Fig.2 Effect of temperature on producting cutinase

為了考察溫度對(duì)菌株產(chǎn)角質(zhì)酶的影響，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為營養(yǎng)，分別于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃等溫度條件下發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)6d后測(cè)酶活，結(jié)果見圖2。從圖2可以發(fā)現(xiàn)，30℃發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)可以獲得最高的角質(zhì)酶酶活，說明此溫度條件下棉花枯萎病菌表達(dá)的角質(zhì)酶量達(dá)到最大。因此，可該菌確定產(chǎn)角質(zhì)酶酶的最適溫度為30℃。

菌株和酶的活性和其活性狀態(tài)都與環(huán)境的pH值有著密切的關(guān)系，培養(yǎng)基的pH值是影響微生物菌種生長和生產(chǎn)的一個(gè)重要的環(huán)境因素。在研究中將基礎(chǔ)培養(yǎng)基的初始pH值分別調(diào)至6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)6d后測(cè)酶活，結(jié)果見圖3。

圖3 初始pH值對(duì)產(chǎn)角質(zhì)酶的影響Fig.3 Effect initial pH value on cutin enzyme production

圖3確定了該菌產(chǎn)角質(zhì)酶的最佳初始pH值，表明在pH 6.5～8.5范圍內(nèi)，隨著pH值升高，酶活也逐漸升高，pH值＞8.5以后，隨pH值的升高酶活力降低，所以pH 8.5是該菌產(chǎn)酶最佳酸堿度。

2.3 培養(yǎng)時(shí)間及角質(zhì)對(duì)酶的產(chǎn)生的影響

將斜面的菌種活化，接入裝有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，再按2%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、160r/min搖床振蕩培養(yǎng)，分別在1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d取樣、過濾、離心、測(cè)酶活，且每個(gè)樣品做3個(gè)平行樣。以不加角質(zhì)樣作為對(duì)照，結(jié)果見圖4。

圖4 培養(yǎng)時(shí)間及角質(zhì)對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of training time and cutin on enzyme production

圖4表明，棉花枯萎病菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)，角質(zhì)酶的活性在第6d時(shí)達(dá)到最高，之后隨著發(fā)酵時(shí)間的增加活性逐漸降低，因此可確定產(chǎn)酶最佳時(shí)間為6d。從圖4還可以看出，在培養(yǎng)基中添加0.2%的蕃茄角質(zhì)后，菌種產(chǎn)角質(zhì)酶的量明顯有所提高，比未添加角質(zhì)時(shí)提高了3倍，產(chǎn)酶量最高達(dá)到29.46U/mL，比未誘導(dǎo)時(shí)提高至4倍。因?yàn)槠洚a(chǎn)酶量提高4倍的情況還不夠穩(wěn)定，因此本文選擇了產(chǎn)酶量提高的平均水平，即19.06U/mL，比未添加時(shí)提高3倍。這充分說明角質(zhì)酶是誘導(dǎo)酶，微量的角質(zhì)就對(duì)菌種產(chǎn)角質(zhì)酶起到了明顯的誘導(dǎo)作用，利用角質(zhì)誘導(dǎo)棉花枯萎病菌（F.oxysporum）產(chǎn)角質(zhì)酶，這也與角質(zhì)酶是一種誘導(dǎo)酶的結(jié)論是相符的，也說明誘導(dǎo)法是簡便可行的有效方法。這充分說明角質(zhì)酶是誘導(dǎo)酶，微量的角質(zhì)就對(duì)菌種產(chǎn)角質(zhì)酶起到了明顯的誘導(dǎo)作用。

2.4 連續(xù)誘導(dǎo)

菌種的馴化是通過人工措施使微生物逐步適應(yīng)某一環(huán)境，而定向選育微生物的方法，馴化獲得具有較高耐受力及活動(dòng)能力的菌株。目前報(bào)道較多的例子是用于廢水處理中的微生物，通過馴化得到對(duì)某種污染物具有較高降解能力和耐受力的高效菌株。

酶的合成受到基因表達(dá)的調(diào)控，也就是說，生物在生長發(fā)育過程中，基因表達(dá)可按一定時(shí)間程序發(fā)生改變，而且隨著內(nèi)外環(huán)境的變化而加以調(diào)控，這就是基因表達(dá)的時(shí)序調(diào)節(jié)和適應(yīng)調(diào)節(jié)，基因表達(dá)的調(diào)節(jié)可以在不同水平（包括轉(zhuǎn)錄前、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后）或在翻譯的水平（包括翻譯和翻譯后）[17]。當(dāng)在培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)物，誘導(dǎo)物能夠激活其基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，合成有關(guān)的信使核糖核酸（mRNA），并翻譯成誘導(dǎo)酶。

按照操作流程，每一梯度發(fā)酵后，培養(yǎng)液以5000r/min轉(zhuǎn)速離心30min，傾去上清液，再加入蒸餾水100mL，再離心。重復(fù)3次。傾去上清，烘干至質(zhì)量恒定，稱質(zhì)量，結(jié)果見圖5～圖7。

圖5 菌種在各梯度下生長情況Fig.5 Bacteria growth in the gradient

在研究中設(shè)計(jì)了一個(gè)梯度環(huán)境，此環(huán)境的培養(yǎng)基中碳源角質(zhì)與土豆汁之間的含量對(duì)應(yīng)變化。逐漸降低培養(yǎng)基中土豆汁的含量，并逐漸提高角質(zhì)的含量，使得較易被棉花枯萎病菌（F.oxysporum）利用的碳源土豆汁的含量不斷減少，而角質(zhì)含量逐漸增加，使棉花枯萎病菌需要分泌產(chǎn)生更多的角質(zhì)酶來適應(yīng)新的環(huán)境。在這過程中如果枯萎病菌能利用角質(zhì)作為碳源，這將更有利于角質(zhì)酶的表達(dá)。梯度環(huán)境可以使得棉花枯萎病菌（F.oxysporum）的角質(zhì)酶基因一直處于激活狀態(tài)，角質(zhì)酶基因的轉(zhuǎn)錄量隨著環(huán)境中角質(zhì)含量的增加而逐步升高，角質(zhì)酶的產(chǎn)量也會(huì)維持在一個(gè)逐步升高的水平上。

從圖6可以看出，隨著培養(yǎng)基中土豆汁含量的減少，菌體細(xì)胞干質(zhì)量隨之減少，說明土豆汁與棉花枯萎病菌（F.oxysporum）生長量有著密切相關(guān)的關(guān)系，也說明了棉花枯萎病菌不能像利用土豆汁那樣利用角質(zhì)進(jìn)行菌體的生長繁殖，角質(zhì)還不能完全替代土豆汁作為碳源。但從結(jié)果（圖7）可以看出，培養(yǎng)基中產(chǎn)的角質(zhì)酶并沒有隨真菌生物量的減少而降低，反而有明顯的增加。說明了連續(xù)的誘導(dǎo)可以提高棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum）產(chǎn)酶的能力。加入角質(zhì)連續(xù)誘導(dǎo)后，角質(zhì)酶的產(chǎn)量有了明顯的提高，一般情況可以提高3倍，最高可以達(dá)到29.46U/mL，比未誘導(dǎo)時(shí)產(chǎn)酶能力提高至4倍。

圖6 土豆汁含量對(duì)菌體干質(zhì)量的影響Fig.6 Effect of potato juice content on dry cell weight

由圖6、圖7可知，當(dāng)營養(yǎng)相對(duì)豐富時(shí)，真菌的生物量能夠得到一定的積累，經(jīng)過角質(zhì)誘導(dǎo)后，產(chǎn)角質(zhì)酶的量就會(huì)大大的提高；角質(zhì)酶是一種誘導(dǎo)酶，角質(zhì)能夠激活角質(zhì)酶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，不斷降低其他易被利用的碳源含量并同時(shí)提高角質(zhì)在其中的含量，使得棉花枯萎病菌始終處于產(chǎn)酶較高的水平。

圖7 真菌生物量對(duì)酶活的影響Fig.7 Effect of fungal biomass on the enzyme activity

在發(fā)酵產(chǎn)酶過程中，為了提高酶的產(chǎn)量，除了選育優(yōu)良的產(chǎn)酶細(xì)胞，保證發(fā)酵工藝條件并根據(jù)需要和變化情況進(jìn)行及時(shí)調(diào)節(jié)控制以外，還可以采取某些行之有效的措施如添加誘導(dǎo)物、控制阻遏物濃度、添加表面活性劑或其他產(chǎn)酶促進(jìn)劑等[18]。

對(duì)于誘導(dǎo)發(fā)酵生產(chǎn)，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適量誘導(dǎo)物，使產(chǎn)酶量顯著提高。誘導(dǎo)物一般可分為3類：酶的作用底物、酶的催化反應(yīng)產(chǎn)物、酶的底物類似物。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，角質(zhì)酶是一種誘導(dǎo)酶，其誘導(dǎo)物是角質(zhì)酶的作用底物角質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)，相對(duì)于無角質(zhì)存在的發(fā)酵過程，添加角質(zhì)后的產(chǎn)酶量得以顯著的提高。對(duì)照?qǐng)D6、圖7，可以得出這樣的結(jié)論，角質(zhì)酶活性的提高并不是因?yàn)槊藁菸【敝沉康奶岣?，而是角質(zhì)加入量的增加（圖6、圖7中的第四梯度）提高了菌株對(duì)角質(zhì)酶的表達(dá)。

3 結(jié)論

角質(zhì)酶的基因在受到角質(zhì)的誘導(dǎo)作用下被激活，會(huì)表達(dá)產(chǎn)生更多的角質(zhì)酶。本實(shí)驗(yàn)采用連續(xù)誘導(dǎo)法培養(yǎng)菌株，控制培養(yǎng)基中的土豆汁與角質(zhì)的含量，使得菌株一直處于一個(gè)有角質(zhì)存在的環(huán)境中。而且土豆汁的含量越來越少，角質(zhì)越來越多，這就說明角質(zhì)酶活的增加不是菌株生物量的增加帶來的，而是角質(zhì)誘導(dǎo)的作用使菌株的角質(zhì)酶表達(dá)能力提高了。在這樣的環(huán)境下角質(zhì)酶基因的表達(dá)會(huì)因角質(zhì)的存在保持在一個(gè)較高的水平上，從而達(dá)到保持菌種產(chǎn)角質(zhì)酶能力的一個(gè)較高水平。

角質(zhì)酶的應(yīng)用十分廣泛，其在食品工業(yè)、化工工業(yè)及印染工業(yè)等許多領(lǐng)域都有應(yīng)用。近幾年還發(fā)現(xiàn)，角質(zhì)酶可用于化纖面料的表面修飾及棉散纖維前處理[11]。但沒有大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)角質(zhì)酶，因此提高角質(zhì)酶產(chǎn)量的研究具有廣泛的理論與實(shí)踐意義。

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