分離自煙臺(tái)白玉霓種植園的釀酒酵母發(fā)酵特性研究

程仕偉，李林林，繆 靜，姜文廣，沈志毅，李記明*

（1.魯東大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 應(yīng)用微生物研究所，山東 煙臺(tái) 264001；2.煙臺(tái)張?jiān)＜瘓F(tuán)有限公司 技術(shù)中心，山東 煙臺(tái) 265709）

在影響葡萄酒質(zhì)量的諸多因素中，發(fā)酵微生物、工藝條件、釀酒設(shè)備和生態(tài)條件與葡萄品種4個(gè)方面起了決定性的作用，這些因素的相互影響最終決定了葡萄酒的品質(zhì)，而釀酒微生物是葡萄酒質(zhì)量和感官風(fēng)格的決定性因素[1-3]。在其他因素相對(duì)穩(wěn)定的情況下，葡萄酒酵母的釀酒適應(yīng)性和釀造學(xué)特性在生產(chǎn)中的重要作用就顯得十分突出[4]。釀酒酵母性能的優(yōu)劣直接影響著葡萄酒品質(zhì)，其將葡萄汁中的糖類(lèi)轉(zhuǎn)化為乙醇和CO2并生成高級(jí)醇酯類(lèi)醛類(lèi)等重要風(fēng)味物質(zhì)[5-7]。優(yōu)良葡萄酒酵母具備啟動(dòng)發(fā)酵速度快、發(fā)酵能力強(qiáng)、殘?zhí)巧?、揮發(fā)酸少、耐高酒精度、高SO2和酒體協(xié)調(diào)等優(yōu)點(diǎn)[8-9]。然而目前多數(shù)葡萄酒生產(chǎn)企業(yè)大量使用進(jìn)口活性干酵母，雖保證了發(fā)酵速率和產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，卻導(dǎo)致葡萄酒品質(zhì)出現(xiàn)同質(zhì)化嚴(yán)重的問(wèn)題[10]。

優(yōu)質(zhì)葡萄酒的生產(chǎn)需要具有產(chǎn)區(qū)特征且能體現(xiàn)葡萄酒特色和風(fēng)格的優(yōu)良酵母菌種[11]。因此加快我國(guó)本土釀酒酵母資源的開(kāi)發(fā)利用，是生產(chǎn)特種葡萄酒的重要保證[12]。山東煙臺(tái)是我國(guó)釀酒葡萄及葡萄酒的主產(chǎn)區(qū)，從當(dāng)?shù)氐钠咸褕@區(qū)及特定的環(huán)境條件中分離具有優(yōu)良特性的葡萄酒酵母，對(duì)釀造具有地域特色和獨(dú)特風(fēng)格的產(chǎn)地葡萄酒有著重要的價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)以分離自煙臺(tái)白玉霓葡萄種植區(qū)的釀酒酵母為研究對(duì)象，通過(guò)其與商品化進(jìn)口活性干酵母的發(fā)酵特性比較研究，為后續(xù)深入研究進(jìn)而選育具有工業(yè)化應(yīng)用潛力的菌株提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

自煙臺(tái)白玉霓葡萄種植園的葡萄葉片、果實(shí)、土壤和葡萄須根部位取樣，經(jīng)孟加拉紅選擇性篩選獲得本土酵母41個(gè)，經(jīng)鑒定有3株菌為釀酒酵母，分別為ZYYT-1、ZYYT-2、ZYYT-3。商品化酵母Actiflore F33 購(gòu)自Laffort 公司，EC1118購(gòu)自法國(guó)Lallemand公司，均由煙臺(tái)張?jiān)＜瘓F(tuán)技術(shù)中心提供。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

采用YPD（yeast extract peptone dextrose medium）培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L。所有試劑均為分析純或生物純。

1.3 發(fā)酵性能指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 發(fā)酵力測(cè)定

CO2失重法：將2%接種量的種液轉(zhuǎn)接到300mL滅菌的YPD培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)。以CO2產(chǎn)生量為縱坐標(biāo)，發(fā)酵時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制CO2產(chǎn)生量曲線。

1.3.2 產(chǎn)酒精能力測(cè)定

重鉻酸鉀比色法：用重鉻酸鉀氧化乙醇為醋酸后，根據(jù)反應(yīng)中生成的Cr3+的顏色在波長(zhǎng)610nm處進(jìn)行比色，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中得出所含的酒精含量[13-14]。

1.3.3 總酸含量測(cè)定

采用國(guó)標(biāo)GB/T 15038-2006中的指示劑法，利用酸堿滴定原理，以酚酞作指示劑，用堿標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)堿的用量計(jì)算總酸含量[15]。

1.3.4 殘?zhí)橇繙y(cè)定

采用DNS比色法測(cè)定還原糖的含量。發(fā)酵液經(jīng)8000r/min離心2min得發(fā)酵上清液，取稀釋后的上清液1mL于試管中，加入1mL蒸餾水和3mL DNS試劑，煮沸10min，待冷卻后定容至25mL，波長(zhǎng)540nm處測(cè)其吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查出對(duì)應(yīng)的葡萄糖量。

1.3.5 釀酒酵母耐受性測(cè)定

采用不同乙醇濃度（12%vol、14%vol、16%vol、18%vol）、檸檬酸濃度（1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、SO2濃度（60mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L）的6mL YPD培養(yǎng)基（內(nèi)裝有杜氏管），接種已活化的菌液一環(huán)，28℃恒溫培養(yǎng)48h，記錄起始發(fā)酵時(shí)間并觀察產(chǎn)生氣泡的現(xiàn)象。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵力比較

圖1 釀酒酵母的發(fā)酵力Fig.1 The fermenting power ofSaccharomyces cerevisiae

釀酒酵母發(fā)酵力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。在接種后的24h內(nèi)，所有菌株均能快速啟動(dòng)發(fā)酵。3株本土酵母菌中，盡管YTZY-2菌株前期啟動(dòng)發(fā)酵能力略低于YTZY-1，但是其總體發(fā)酵產(chǎn)氣量均高于YTZY-1和YTZY-3。從篩選的本土釀酒酵母與商品化酵母的發(fā)酵力比較看，3株本土酵母的發(fā)酵能力低于Actiflore F33，但是高于EC1118，其中YTZY-2的發(fā)酵產(chǎn)氣量與Actiflore F33非常接近，故YTZY-2是實(shí)際釀酒應(yīng)用的潛力菌株。

2.2 產(chǎn)酒精能力與殘?zhí)橇拷Y(jié)果分析

從圖2可以看出，產(chǎn)酒精能力依次為YTZY-2＞YTZY-1＞EC1118＞Actiflore F33＞YTZY-3，YTZY-2和YTZY-1具有高產(chǎn)酒精能力，甚至高于商品化酵母EC1118和Actiflore F33。發(fā)酵液中的殘?zhí)橇靠梢苑从辰湍笇?duì)糖的轉(zhuǎn)化利用能力，如果初始含糖量相同，發(fā)酵結(jié)束后殘?zhí)橇康停f(shuō)明酵母對(duì)糖的轉(zhuǎn)化利用率高，則說(shuō)明發(fā)酵能力強(qiáng)[16]。由圖3可以看出，與產(chǎn)酒精能力對(duì)應(yīng)的，發(fā)酵結(jié)束后YTZY-2菌株的殘?zhí)呛孔畹?，甚至低于商品化酵母的發(fā)酵殘?zhí)橇?，表明菌株利用糖?lèi)的能力較強(qiáng)，發(fā)酵較為徹底。

圖2 釀酒酵母產(chǎn)酒精能力Fig.2 The producing ability of alcohol bySaccharomyces cerevisiae

圖3 釀酒酵母的發(fā)酵殘?zhí)橇縁ig.3 Residual sugar content after 48h fermentaion bySaccharomyces cerevisiae

2.3 發(fā)酵后總酸量

總酸含量用來(lái)判定酵母產(chǎn)酸能力，酸類(lèi)物質(zhì)雖不是酒類(lèi)的香氣成分，但其是主要的呈味物質(zhì)。從圖4可以看出，產(chǎn)酸能力依次為YTZY-3＞YTZY-1＞EC1118＞YTZY-2＞Actiflore F33，其中YTZY-2菌株產(chǎn)酸量與商品化酵母EC1118和Actiflore F33基本處于同一水平。酸類(lèi)物質(zhì)雖然是主要的呈味物質(zhì)，但是過(guò)高或過(guò)低均影響口感，酸含量需適中，否則將影響酒類(lèi)的色、香、味[3]。綜上分析，初步判定篩選的釀酒酵母YTZY-2具有生產(chǎn)特色葡萄酒的潛力。

圖4 釀酒酵母的發(fā)酵產(chǎn)酸量Fig.4 Produced acid content bySaccharomyces cerevisiae

2.4 耐受酒精能力

釀酒酵母耐受酒精能力的結(jié)果見(jiàn)表1。商品化酵母EC1118和F33以及本土酵母YTZY-2均具有較好的酒精耐受力，其中EC1118在酒精度為18%vol時(shí)仍能繼續(xù)發(fā)酵，而YTZY-1和YTZY-3的耐受酒精能力較差。工業(yè)化葡萄酒釀造過(guò)程中酒精度一般為12%vol，YTZY-2、EC1118和F33在酒精度為12%vol時(shí)仍能夠持續(xù)發(fā)酵，具有較好酒精耐受能力。YTZY-2可以耐受的酒精度為16%vol。

表1 釀酒酵母對(duì)酒精濃度的耐受力Table 1 Alcohol tolerance ofSaccharomyces cerevisiae

2.5 耐受SO2能力

由表2可以看出，供試酵母耐受SO2能力大小為Actiflore F33＞EC1118＞YTZY-2＞YTZY-3＞YTZY-1，Actiflore F33在SO2濃度為200mg/L時(shí)仍能持續(xù)發(fā)酵，而YTZY-1耐受SO2能力較差。一般SO2在葡萄汁中添加量為一般為60mg/L即可起到較好的抑制雜菌效果，YTZY-2在SO2濃度為60mg/L時(shí)可以較好的發(fā)酵，可以耐受的SO2濃度為150mg/L，可以用于葡萄酒實(shí)際生產(chǎn)中。

表2 釀酒酵母耐受SO2 的能力Table 2 SO2 tolerance ofSaccharomyces cerevisiae

2.6 耐酸能力

表3 釀酒酵母的耐酸能力Table 3 Acid tolerance of Saccharomyces cerevisiae

由表3可以看出，供試酵母耐受酸能力大小為Actiflore F33＞EC1118＞YTZY-2＞YTZY-3＞YTZY-1，Actiflore F33在檸檬酸質(zhì)量濃度為3%時(shí)仍能持續(xù)發(fā)酵，而YTZY-1和YTZY-3耐酸能力較差。YTZY-2可以耐受檸檬酸質(zhì)量濃度為2.5%。

3 結(jié)論

通過(guò)煙臺(tái)白玉霓葡萄種植園篩選的本土釀酒酵母與商品化活性干酵母的發(fā)酵特性比較研究，確定菌株YTZY-2的發(fā)酵力和產(chǎn)酒精能力較強(qiáng)，產(chǎn)酸量適中，具有較強(qiáng)的工業(yè)化應(yīng)用潛力，而YTZY-1和YTZY-3的發(fā)酵效果欠佳。菌株耐受性比較研究表明，本土葡萄酒酵母YTZY-2具有一定的耐受酒精度、SO2和酸度能力，能夠在工業(yè)發(fā)酵條件下正常發(fā)酵。有關(guān)YTZY-2菌株的葡萄汁實(shí)際發(fā)酵效果評(píng)價(jià)正在進(jìn)行中。

[1]RASPOR P,MILEK DM,POLANC J,et al.Yeasts isolated from three varieties of grapes cultivated in different locations of the Dolenjska vinegrowing region,Slovenia[J].Int J Food Microbiol,2006,109:97-102.

[2]LI X,CHAN LJ,YU B,et al.Fermentation of three varieties of mango juices with a mixture ofSaccharomyces cerevisiaeandWilliopsis saturnusvar.mrakii[J].Int J Food Microbiol,2012,158(1):28-35.

[3]王 紅，劉天明，劉思喜.天然優(yōu)良葡萄酒酵母發(fā)酵特性研究[J].釀酒科技，2012，219（9）：75-77.

[4]LV XC,HUANG XL,ZHANG W,et al.Yeast diversity of traditional alcohol fermentation starters for Hong Qu glutinous rice wine brewing,revealed by culture-dependent and culture-independent methods[J].Food Control,2013,34(1):183-190.

[5]KRAKOVA L,CHOVANOVA K,ZENISOVA K,et al.Yeast diversity investig ation of wine-related sample s from two different Slovakian wine-producing areas through a multistep procedure[J].LWT-Food Sci Technol,2012,46(2):406-411.

[6]CAPECE A,SIESTO G,LAGRECA VM,et al.Assessme nt of competition in wine fermentat ion amon g wildSaccharomyces cerevisiaestrains isolated from Sangiovese grapes in Tuscany region[J].LWT-Food Sci Technol,2013,54(2):485-492.

[7]郭志剛，劉天明，趙長(zhǎng)增.甘肅天然優(yōu)良酵母菌株的發(fā)酵特性評(píng)價(jià)[J].中國(guó)釀造，2008，27（11）：19-22.

[8]STRINGINI M,COMITINI F,TACCARI M,et al.Yeast diversity during tapping and fermentation of palm wine from Cameroon[J].Food Microbiol,2009,26(4):415-420.

[9]CLAVIJO A,CALDERON IL,PANEQUE P.Diversity ofSaccharomycesand non-Saccharomycesyeasts in three red grape varieties cultured in theSerranía de Ronda(Spain)vine-growing region[J].Int J Food Microbiol,2010,143(3):241-245.

[10]湯曉宏，胡文效.葡萄釀酒酵母研究進(jìn)展[J].中外葡萄與葡萄酒，2012（5）：53-57.

[11]薛 波，韓 娜，侯 敏，等.7 株葡萄野生酵母菌的特性研究[J].中國(guó)釀造，2009，28（10）：19-21.

[12]苑 偉，王學(xué)鋒，劉延琳.優(yōu)選釀酒酵母菌株發(fā)酵性能研究[J].中國(guó)釀造，2010，29（9）：48-52.

[13]魏冬梅，張艷芳，張予林.利用比色法測(cè)定葡萄酒的酒精度[J].食品工業(yè)，2001（4）：45-46.

[14]邵法都，梅朝勇，沈振新.用比色法測(cè)定啤酒中的酒精度[J].釀酒，1999，131（2）：89-90.

[15]GB/T 15038-2006.葡萄酒、果酒通用分析方法[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2007.

[16]RUBEN DBG,MIRIAM OH,MONTSERRAT SI,et al.Interactions of phenolic and volatile compounds with yeast lees,commercial yeast derivatives and non toasted chips in model solutions and young red wines[J].Eur Food Res Technol,2012,234(2):231-244.