灰樹花發(fā)酵液對小鼠抗疲勞作用的實驗研究

王金菊，黃 劍，李 超，王艷萍*

（天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院，天津 300457）

灰樹花（Grifola frondasa）又名貝葉多孔菌（polyporus frondosus）。其外觀灰白色，如卷心菜大，風味獨特，是近年來開發(fā)的珍奇食藥兩用菌之一[1]?；覙浠ǖ亩喾N營養(yǎng)素居各種食用菌之首[2]，灰樹花具有極高的醫(yī)療保健功能。從20世紀80年代開始，國內(nèi)外學者對其進行了大量研究，從灰樹花子實體和菌絲體中提取了幾十種活性多糖[3-4]。經(jīng)過大量的化學和藥理藥效研究證明，灰樹花發(fā)酵液中的活性多糖具有明顯的抗腫瘤[5]、抗HIV病毒[6]、改善免疫系統(tǒng)[7]、降血脂[8]、降血糖和降膽固醇[9-10]等生物活性，而其抗疲勞的效果鮮見文獻報道。

運動耐力實驗和生化指標的測定是評價疲勞的2個主要方法，負重游泳實驗是運動耐力實驗的方法之一，游泳時間的長短可以反應動物運動疲勞的程度[11]。在生化指標的評價中，血清尿素氮（SUN）的含量主要反映機體內(nèi)蛋白質(zhì)的代謝情況，機體在長時間運動后就會開始消耗體內(nèi)蛋白質(zhì)，從而產(chǎn)生大量的SUN，機體對運動負荷的適應性越低，形成的尿素越多；反之，機體運動后SUN含量越低，表明機體對運動負荷的適應能力強，疲勞的產(chǎn)生就會得到延緩。乳酸脫氫酶（LDH）可以氧化機體血液中的乳酸，從而降低血液中乳酸的含量，使機體回復正常的pH值水平，故LDH活性的增強可以大大加速血液乳酸的清除速率，進而提高機體的抗疲勞能力[12-13]。本研究通過小鼠負重游泳實驗、SUN、LDH指標的測定及跑籠實驗探究灰樹花發(fā)酵液的抗疲勞活性，為灰樹花發(fā)酵液在功能性食品中的應用提供一定的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

灰樹花菌株（Grifola frondosa）由本實驗室保存。

1.1.2 實驗動物

昆明種小鼠60只，雄性，體質(zhì)量（20±2）g，中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院動物中心提供；許可證號：SCXK-（軍）2010-025。動物飼養(yǎng)在天津科技大學清潔級動物實驗房完成（環(huán)境設(shè)施合格證號：SYXK（津）2006-0005）。

1.1.3 試劑與主要儀器

乳酸脫氫酶試劑盒、尿素氮試劑盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；DELTA-320型pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜：上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司；7L氣升式發(fā)酵罐（上海保興7L）：上海保興公司；SM-510型全自動滅菌鍋：日本YAMATO公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 灰樹花發(fā)酵液的制備

發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖22g/L，蛋白胨3g/L，KH2PO40.8g/L；MgSO41.2g/L，115℃高壓滅菌30min，將種子發(fā)酵液按10%（v/v）接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃、140r/min發(fā)酵培養(yǎng)14d，抽濾去除菌體，得到灰樹花發(fā)酵液。將發(fā)酵液進行旋蒸，濃縮至固形物含量為4%（w/v）和8%（w/v），分別作為動物實驗的低濃度組和高濃度組待試樣品。

1.2.2 動物分組與給藥

將小鼠隨機分為空白組、灰樹花發(fā)酵液低濃度和高濃度組，每組各12只。樣品組分別灌喂0.2mL低濃度和高濃度的發(fā)酵液，空白組灌喂相同體積的生理鹽水，連續(xù)灌喂25d，小鼠正常的飲食和攝水，25d后測定小鼠的體質(zhì)量。

1.2.3 負重游泳實驗

每組選用6只小鼠，末次給予小鼠受試物30min后，置小鼠于游泳箱中游泳，水深為35cm，水溫為（25.0±0.5）℃，鼠尾根部負荷5%（w/w）體質(zhì)量的鉛皮。記錄小鼠從游泳開始至力竭的時間，作為小鼠游泳力竭時間。

力竭標準：小鼠沉入水面以下8s，無法上浮。

1.2.4 血尿素氮（BUN）和乳酸脫氫酶（LHD）的測定

每組選用6只小鼠，末次給予小鼠受試物30min后，在溫度為（30±0.5）℃的水中不負重游泳90min，休息60min后，采血清0.5mL，依照BUN和LHD試劑盒說明書操作。

1.2.5 灰樹花發(fā)酵液與同類產(chǎn)品的抗疲勞效果比較

將小鼠隨機分為空白組、發(fā)酵組、佳得樂組（陽性對照）和紅牛組（陽性對照），每組各12只。發(fā)酵液組灌喂0.2mL發(fā)酵液（濃縮至固形物含量為8%），其他各組分別灌以相同體積的生理鹽水、佳得樂和紅牛，每天灌胃1次，連續(xù)25d后測定小鼠體質(zhì)量、負重游泳試驗、BUN和LHD含量，具體測定方法參考1.2.3和1.2.4。

1.2.6 跑籠實驗研究抗疲勞效果

將小鼠隨機分為空白組、發(fā)酵液組、佳得樂組（陽性對照）和紅牛組（陽性對照），每組各6只。發(fā)酵液組灌胃0.2mL發(fā)酵液（濃縮至固形物含量為8%（w/v）），其他各組分別灌以相同體積的生理鹽水、佳得樂和紅牛，每天灌喂1次，連續(xù)25d后，將跑鼠籠置于水槽內(nèi)使其1/3浸沒于水面之下，并使水溫控制在（15±2）℃。經(jīng)過預實驗設(shè)定小鼠的疲勞閾值為跑籠速度2r/min，當小鼠運動速度低于閾值時，認為其處于疲勞狀態(tài)。小鼠灌胃后8min跑籠，測定其跑籠速度和跑籠時間。因飲料功效不同，跑籠速度快，持續(xù)時間長，可認為該飲料對疲勞小鼠體力恢復的效果好。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度發(fā)酵液對小鼠抗疲勞能力的影響

2.1.1 灰樹花發(fā)酵液對小鼠體質(zhì)量的影響

表1 灰樹花發(fā)酵液對小鼠體質(zhì)量的影響(±s,n=12)Table 1 Effect of broth on body weight of mice(±s,n=12)

表1 灰樹花發(fā)酵液對小鼠體質(zhì)量的影響(±s,n=12)Table 1 Effect of broth on body weight of mice(±s,n=12)

注：與空白組相比較，“*”表示p＞0.05。

表1顯示，3組小鼠灌喂25d后體質(zhì)量均有增加，但與空白對照組比較，低濃度組和高濃度組在體質(zhì)量上無顯著性差異。表明灰樹花發(fā)酵液對小鼠體質(zhì)量增長無顯著影響。

2.1.2 對負重游泳力竭時間、BUN及LHD的影響

表2 發(fā)酵液對小鼠負重游泳力竭時間、BUN和LHD的影響（±s,n=6）Table 2 Effect of broth on exhausted time of mice in swimming,BUN and LHD（±s,n=6）

表2 發(fā)酵液對小鼠負重游泳力竭時間、BUN和LHD的影響（±s,n=6）Table 2 Effect of broth on exhausted time of mice in swimming,BUN and LHD（±s,n=6）

注：與空白組相比較，“*”表示p＜0.05。

從表2可以看出，對于游泳力竭時間，t(高濃度組)＞t(低濃度組)＞t(空白組)，與空白組相比，高濃度組有顯著性差異，但低濃度組與空白組相比沒有顯著性差異。無論從各組的均值還是顯著性差異來看，高濃度的灰樹花發(fā)酵液是有助于延長力竭游泳時間。

通過BUN濃度的比較可以發(fā)現(xiàn)，C(高濃度組)＜C(空白組)＜C(低濃度組)，與空白組相比，高濃度組BUN濃度具有顯著性差異（p＜0.05）；但低濃度組與空白對照組之間沒有顯著性差異（p＞0.05），這說明高濃度的灰樹花發(fā)酵液是有助于緩解蛋白質(zhì)與氨基酸分解代謝，增強了對負荷的適應性。此外，對于各組小鼠的LHD活力，U(低濃度)＞U(高濃度)＞U(空白組)，低濃度組和高濃度組的LHD活力都很高；與空白組相比，高濃度組和低濃度組都具有顯著性差異（p＜0.05），但是高濃度組和低濃度組之間無顯著性差異，也就是說，說明灰樹花發(fā)酵液有助于減少運動后乳酸在肌肉中的堆積，提高小鼠對負荷的適應性，從而緩解疲勞狀態(tài)。

2.2 發(fā)酵液與同類產(chǎn)品的抗疲勞效果比較

2.2.1 各樣品對小鼠體質(zhì)量的影響

表3 發(fā)酵液、佳得樂和紅牛對小鼠體質(zhì)量的影響(±s,n=12)Table 3 Effect of broth,Gatorade and Red Bull on body weight of mice (±s,n=12)

表3 發(fā)酵液、佳得樂和紅牛對小鼠體質(zhì)量的影響(±s,n=12)Table 3 Effect of broth,Gatorade and Red Bull on body weight of mice (±s,n=12)

注：與空白組相比較，“*”表示p＜0.05。

由表3可以看出，4組小鼠給藥25d后體質(zhì)量均有增加，與空白組相比，發(fā)酵液組和陽性組都無顯著性差異，表明發(fā)酵液組、佳得樂和紅牛對體質(zhì)量無顯著影響（p＞0.05）。

2.2.2 對負重游泳力竭時間、BUN及LHD的影響

表4 發(fā)酵液、佳得樂和紅牛對小鼠負重游泳時間、BUN和LHD的影響（±s,n=6）Table 4 Effect of broth,Gatorade and Red Bull on exhausted time in swimming,BUN and LHD（±s,n=6）

表4 發(fā)酵液、佳得樂和紅牛對小鼠負重游泳時間、BUN和LHD的影響（±s,n=6）Table 4 Effect of broth,Gatorade and Red Bull on exhausted time in swimming,BUN and LHD（±s,n=6）

由表4可以看出，對于各組小鼠的力竭游泳時間，t(紅牛組)＞t(發(fā)酵液組)＞t(空白組)＞t(佳得樂)，與空白組和佳得樂組相比，發(fā)酵液組和紅牛組都具有極顯著性差異（p＜0.01），雖然發(fā)酵液組與紅牛組相比游泳時間更長，但兩組之間并無顯著性差異。

通過BUN濃度的比較可以發(fā)現(xiàn)，C(發(fā)酵液組)＜C(佳得樂)＜C(紅牛組)＜C(空白組)，與空白組相比，發(fā)酵液組、佳得樂組和紅牛組都具有顯著性差異（p＜0.05），但是該3組之間并無顯著性差異。綜上所述，灰樹花發(fā)酵液具有同佳得樂和紅牛相似的抗疲勞效果，但是該指標結(jié)果不能證明發(fā)酵液比同類產(chǎn)品要更好。

此外，對于各組小鼠的LHD活力，U(發(fā)酵液組)＞U(佳得樂)＞U(紅牛組)＞U(空白組)，即發(fā)酵液組的LDH活力均值最高，但各組之間無無顯著性差異（p＞0.05）。究其原因，可能是組內(nèi)差異要大于組間差異，即組內(nèi)所測得的LDH活力差異性過大。造成這種現(xiàn)象的可能原因是在實驗過程中，由于冬季氣溫較低，少數(shù)對溫度敏感的小鼠，提早出現(xiàn)疲勞和力竭狀態(tài)；而相對耐寒的小鼠則更容易適應本次實驗，這樣最終造成了組內(nèi)的差異遠超過組間的差異，進而無法通過方差分析得出組間的顯著性差異。

2.3 跑籠實驗結(jié)果

2.3.1 對小鼠跑籠時間和速度的影響

表5 發(fā)酵液、佳得樂和紅牛對小鼠跑籠時間和速度的影響（±s,n=6）Table 5 Effect of broth,Gatorade and Red Bull on time and speed of mice(±s,n=6)

表5 發(fā)酵液、佳得樂和紅牛對小鼠跑籠時間和速度的影響（±s,n=6）Table 5 Effect of broth,Gatorade and Red Bull on time and speed of mice(±s,n=6)

注：與空白組相比較，“*”表示p＜0.05。

由表5可以看出，對于跑籠事件t(發(fā)酵液組)＞t(佳得樂組)＞t(紅牛組)＞t(空白組)，即發(fā)酵液組小鼠在冷水中跑籠時間最長。與空白組相比，發(fā)酵液組存在顯著性差異；但是與陽性對照組（佳得樂和紅牛組）相比，則無顯著性差異。

通過對各組小鼠跑籠速度的分析可以看出，雖然V(發(fā)酵液組)＞V(佳得樂組)＞V(紅牛組)＞V(空白組)，但各組之間并無顯著性差異。這可能是由于組內(nèi)差異大于組間差異[14]所造成的，即組內(nèi)差異性遠大于組間差異性，從進而各組之間的差異不存在顯著性。

2.3.2 對小鼠每分鐘內(nèi)跑籠圈數(shù)的對比分析

表6 各組小鼠每分鐘內(nèi)跑籠圈數(shù)（圈）隨時間的變化Table 6 Change of the lap number per minute with time

由表6和附圖可知，發(fā)酵液組小鼠在整個跑籠過程中，跑籠時間最長而且整體速度比其他3組更快，并且在較短時間內(nèi)達速度峰值（第4min時達最大速度6.30r/min），這間接的反應了實驗組能小鼠能快速適應強度較大的運動。而佳得樂組小鼠跑籠速度和紅牛組小鼠在整體水平上較為接近，跑籠時間也僅僅比紅牛組多1min。從總體趨勢來看，空白組和佳得樂組的跑籠速度上下波動較大，可能是由于個體差異性太大引起的，個別小鼠能快速適應低水溫，有的則不然。

圖1 各組小鼠每分鐘內(nèi)跑籠圈數(shù)隨時間的變化Fig.1 Change of the lap number per minute with time

3 結(jié)論

（1）與陽性對照組相比較，灰樹花發(fā)酵液（濃縮至固形物含量為8%（w/w））具有相似的抗疲勞效果。

（2）與空白組相比較，灰樹花發(fā)酵液在提高體能，緩解疲勞方面具有顯著性的效果，具有開發(fā)成為抗疲勞食品的潛力。

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