紅曲霉的分離篩選

倉義超

（江蘇省宿遷市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所國家白酒檢測中心，江蘇 宿遷 223800）

紅曲霉（Monascus purpureusWent.）中文別名紅曲、紅糟、紅大米，散囊菌目中的一屬子囊菌曲霉科真菌。存在于樹木、土壤和堆積物等。在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，菌落初為白色，老熟后變成淡粉色、紫色或灰黑色，多形成紅色。紅曲可用于釀酒、制醋、作豆腐乳的著色劑和調(diào)味劑，也可作中藥。在酶制劑工業(yè)中也可用其生產(chǎn)糖化酶制劑。近年來，還發(fā)現(xiàn)紅曲產(chǎn)生的活性物質(zhì)具有降膽固醇、降血壓以及預(yù)防和治療其他疾病的功能。在白酒釀造方面，紅曲霉因能產(chǎn)生多種功能性物質(zhì)而得到了廣泛的應(yīng)用和研究。1991年，江蘇雙洋酒廠對本廠的大曲進(jìn)行微生物分離時，分離出一株紅曲霉，所分離的紅曲霉具有極強(qiáng)的產(chǎn)酯能力，在生產(chǎn)應(yīng)用中可以大幅提高大曲的糖化力、發(fā)酵力、液化力和酯化力。本文主要介紹一株優(yōu)良紅曲霉——M-1#的分離篩選及生產(chǎn)應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

清香大曲。

1.2 分離用培養(yǎng)基

麥芽汁培養(yǎng)基：12°Bx麥芽汁，2%瓊脂，pH3.5～5.0。121℃滅菌20min。

1.3 分離方法

曲心和表皮各取5g，放入帶有玻璃珠的90mL無菌水三角瓶中，搖床培養(yǎng)30min，此為10-1濃度菌液，吸取1mL至9mL無菌水中，此為10-2濃度菌液，依次稀釋為10-3、10-4、10-5、10-6濃度菌液。分別吸取0.1mL各梯度濃度菌液至麥芽汁平板中涂布。35℃培養(yǎng)48h。

紅曲霉的形態(tài)特征為菌絲體初期在粳米粒內(nèi)部生長，無色，漸變?yōu)榧t色，并使米粒變成紫紅色。菌絲體大量分枝，含橙紫紅色顆粒，在分枝的頂端產(chǎn)生單個或成串的分生孢子，孢子呈球形或橢圓形，（6.5μm～10.5μm）×（7μm～9μm），閉囊殼橙紅色，近球形，含有多數(shù)子囊，子囊內(nèi)含8個孢子，直徑25μm～75μm，子囊孢子卵形或近球形，光滑，透明，無色或漆紅色，（5.5μm～6μm）×（3.5μm～5μm）。

挑取符合紅曲霉形態(tài)特征的菌種分離純化。

1.4 紅曲霉的篩選方法

分離純化得到3株紅曲霉，轉(zhuǎn)接在固體培養(yǎng)基35℃培養(yǎng)。培養(yǎng)48h。3株紅曲霉分別編號為M-1#、M-2#、M-3#，并制成不同的固體麩曲。

1.4.1 產(chǎn)酯能力的測定

制備酯化液：取100mL 1%己酸乙醇溶液于250mL蒸餾燒瓶中，加入相當(dāng)于5g干曲的曲量，在30℃～32℃保溫酯化100h。然后加水50mL，加熱蒸餾，接收蒸出液100mL，用化學(xué)分析法測定流出液中己酸乙酯含量。測定質(zhì)含量：吸取50mL餾出液，用0.1mol/L氫氧化鈉中和到酚酞終點(diǎn)。準(zhǔn)確加入0.1mol/L氫氧化鈉25mL，沸水浴中回流皂化30min。冷卻后用0.05mol/L硫酸滴定到酚酞粉色消失為終點(diǎn)。

計(jì)算方法參考《白酒技術(shù)生產(chǎn)全書》酯化力及酯分解率測定方法。

1.4.2 糖化力的測定

制備曲子浸出液的糖化試液：稱取5g干曲的曲粉，放在250mL燒杯中，加水（90-5×水分%）mL，緩沖液10mL，在30℃水浴中浸出1h，每隔15min攪拌一次，然后用干濾紙過濾，棄去最初5mL，接收50mL澄清浸出液。準(zhǔn)確吸取2%可溶性淀粉50mL與100mL容量瓶中，在35℃水浴中保溫20min，準(zhǔn)確加入酶浸出液10mL，搖勻并開始計(jì)時，在35℃水浴中準(zhǔn)確保溫1h。立即加入3mL 1mol/L的氫氧化鈉，振蕩，以停止反應(yīng)。再冷卻至室溫，用蒸餾水定容至刻度。制作空白試驗(yàn)液：準(zhǔn)確吸取2%可溶性淀粉溶液50mL于100mL容量瓶中。先加11mol/L氫氧化鈉3mL，混合均勻后在加酶浸出液10mL，用蒸餾水定容，搖勻。

糖化液測定：準(zhǔn)確吸取5mL糖化液于盛有斐林甲、乙液各5mL的150mL三角瓶中，加入適量0.1%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，搖勻，在電爐上加熱至沸后，立即用標(biāo)準(zhǔn)糖液滴定至藍(lán)色消失。空白液測定：以5mL空白液代替糖化液，其他操作同上。

計(jì)算方法參考《白酒技術(shù)生產(chǎn)全書》糖化酶活力測定方法。

1.4.3 聞香測試

將3株菌分別接于150mL液體麥芽汁培養(yǎng)基中35℃培養(yǎng)48h。10000r/min離心1min，留上清培養(yǎng)液聞香。

1.5 M-1#麩曲基酒生產(chǎn)

清香型白酒清蒸清茬工藝：破碎好的高粱（4、6、8瓣）用熱水浸潤24h，裝甑清蒸90min，排除雜味，蒸完后取出攤晾，加入大曲粉等后，拌勻、入缸發(fā)酵，待酒醅發(fā)酵成熟（28d），添加適量輔料，拌勻、蒸酒，蒸餾得到的酒除去酒頭和酒尾后分段存放，簡稱為普通基酒。

清蒸清茬紅曲霉麩曲酒的生產(chǎn)工藝：選用M-1#菌種，擴(kuò)培成M-1#固體麩曲。M-1#基酒與普通基酒工藝不同之處在于，加入大曲后，再加入適量的M-1#麩曲，拌勻，入缸發(fā)酵，其余均相同。蒸餾得到的酒除去酒頭和酒尾后分段存放，簡稱為M-1#基酒。

1.6 化驗(yàn)M-1#基酒的色譜

1.7 對基M-1#酒進(jìn)行品評

2 結(jié)果與分析

2.1 3株紅曲霉酯化力測定結(jié)果

2.2 3株紅曲霉糖化力測定結(jié)果

大曲中的3株紅曲霉經(jīng)過酯化力、糖化力測定后，菌株M-1#較為優(yōu)秀。通過表1、表2可以看出，M-1#糖化力較高，達(dá)到1388.7U/g，酯化力為15.66mg/g，均為3株中最高值。

表1 紅曲酯化力測定Table 1 Determination of esterifying power of Manascus

表2 紅曲糖化力測定Table 2 Determination of saccharification power of Manascus

2.3 聞香測定結(jié)果

表3 紅曲聞香數(shù)據(jù)Table 3 Analysis data of fragrant producing of Manascus

紅曲霉經(jīng)過液體培養(yǎng)后，通過聞香可以初步判斷出其產(chǎn)香能力，通過聞香實(shí)驗(yàn)篩選出產(chǎn)香較好的菌種進(jìn)行釀酒實(shí)驗(yàn)，以提高基酒質(zhì)量。通過表3可以看出，M-1#在聞香上帶果香，且香氣濃郁。通過以上理化性能、聞香可以初步判斷出M-1#為大曲中較為優(yōu)秀的紅曲霉。

2.4 M-1#基酒色譜結(jié)果

表4 兩種不同工藝基酒氣相色譜值Table 4 GC values of two different process base liquors

2.5 M-1#基酒品評結(jié)果

表5 兩種不同工藝基酒品酒評語Table 5 Evaluation of two different process base liquors

2.6 分析

通過表4、表5可以看出，與普通基酒相比，M-1#基酒提高了基酒的乙酸乙酯，降低了乳酯含量，其余組分變化不大。在品評方面，同對照基酒相比，M-1#基酒入口顯甜，酒體協(xié)調(diào)，余味較長，達(dá)到了改善酒質(zhì)的目的。通過釀酒實(shí)驗(yàn)可以看出，從大曲中篩選出的M-1#在白酒釀造過程中達(dá)到了提高出酒率，改善酒質(zhì)的目的，并且起到增乙降乳的作用。M-1#基酒在品評中表現(xiàn)為酯香正，突出，入口顯甜，酒體協(xié)調(diào)，余味較長，尾味凈。其中酯香突出也間接地對應(yīng)上M-1#的聞香特點(diǎn)。

3 實(shí)驗(yàn)總結(jié)

本實(shí)驗(yàn)通過平板分離和生化性能測定方法篩選出一株綜合性能優(yōu)良的紅曲霉菌株，詳細(xì)介紹了釀酒生產(chǎn)中紅曲霉的分離與篩選的全過程，可以作為今后釀酒生產(chǎn)中的指導(dǎo)。隨著微生物技術(shù)的發(fā)展，越來越多的功能性微生物被用于白酒釀造生產(chǎn)過程中。而紅曲霉作為我國應(yīng)用較廣的微生物，憑借其不俗的產(chǎn)香能力、糖化能力以及降乳能力，在近幾年越來越多的應(yīng)用到白酒釀造過程中。紅曲霉的代謝產(chǎn)物主要是與白酒風(fēng)味密切相關(guān)的一些酸醇類物質(zhì)，并且可能具有穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物與代謝途徑。紅曲可以產(chǎn)生很多微量的風(fēng)味物質(zhì)，很可能是其提高酒質(zhì)的原因。作為多種行業(yè)共同使用的功能菌，紅曲霉通過其產(chǎn)香能力、糖化力、酯化力以及調(diào)節(jié)乙乳關(guān)系的能力充分的證明了在清香型白酒發(fā)酵中的作用，而通過紅曲霉生產(chǎn)特色優(yōu)質(zhì)基酒也將是今后的方向。

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