雙水相萃取分離紅豆蛋白質(zhì)

孫亞莉，張喜峰*

（河西學(xué)院 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅 張掖 734000）

紅豆又稱赤豆、小豆、赤小豆、飯豆，為一年生豆科植物，色澤鮮紅、淡紅或深紅。已有研究證明，紅豆中含有蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉、膳食纖維、B族維生素等營養(yǎng)物質(zhì)[1-3]。因此，紅豆具有較高營養(yǎng)價值。我國對紅豆蛋白質(zhì)開發(fā)利用有限，高效充分提取蛋白質(zhì)，促進(jìn)紅豆蛋白功能食品加工可持續(xù)發(fā)展，以期為紅豆蛋白利用開辟新的途徑。

紅豆蛋白質(zhì)現(xiàn)有分離純化技術(shù)包括：堿溶酸沉法[4]、酶解法[5-6]、微波輔助提取法[7]。堿溶酸沉法易導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象變化，蛋白質(zhì)發(fā)生聚集。酶解法周期較長，在分離提取蛋白質(zhì)同時引入酶組分，增加分離純化難度。微波輔助提取法僅適用于熱穩(wěn)定性物質(zhì)的提取，對于熱敏性物質(zhì)，微波加熱可能使其變性或失活。微波萃取過程中細(xì)胞因受熱而破裂，一些不希望得到的組分也會溶解于溶劑中，從而使微波萃取的選擇性顯著降低。雙水相萃取操作條件溫和、處理量大、易于連續(xù)操作、且蛋白質(zhì)能保持其天然的空間構(gòu)型，不易失活[8]。

采用Plackett-Burman設(shè)計法對影響紅豆蛋白萃取率相關(guān)影響因素的效應(yīng)進(jìn)行評價，運(yùn)用最陡爬坡試驗以及Box-Behnken設(shè)計，得到雙水相萃取紅豆蛋白質(zhì)最佳萃取條件，旨在為紅豆蛋白質(zhì)的分離純化和開發(fā)利用提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅豆購自甘肅省張掖市新樂超市；PEG（600、1000、2000、4000、6000）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；硫酸銨、磷酸、考馬斯亮藍(lán)G-250：上海中秦化學(xué)試劑有限公司；牛血清蛋白、氯化鈉：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；95%vol乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉：天津市百世化工有限公司。

PL203電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；XO-SM5O超聲-微波反應(yīng)系統(tǒng)：南京先歐儀器制造有限公司；DKB-501數(shù)顯超級恒溫水浴鍋：揚(yáng)州市三發(fā)電子有限公司；DHG-9101.1電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：揚(yáng)州市三發(fā)電子有限公司；722型分光光度計：上海光譜儀器有限公司；CR-21高速離心機(jī)：日本日立；漩渦混合器：上海精科實業(yè)有限公司；小型粉碎機(jī)：揚(yáng)州市三發(fā)電子有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 粗提液的制備

稱取10g紅豆粉末，置于1000mL磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液中在恒溫30℃條件下浸提60min。在超聲波反應(yīng)系統(tǒng)下對紅豆蛋白進(jìn)行提取，將得到的懸濁液于6000r/min離心10min，傾倒上清液可得到含紅豆蛋白質(zhì)的粗提液，測定粗提液中蛋白質(zhì)含量。

1.2.2 考馬斯亮藍(lán)G-250測定蛋白含量[9]

取5支試管，分別精確吸取牛血清蛋白原液0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL，用蒸餾水全部稀釋至1.0mL，然后分別加入5.00mL考馬斯亮藍(lán)溶液，混合均勻，于（25±1）℃的恒溫水浴中保溫10min，冷水浴中冷卻后，立即于波長595nm處比色測定。以1.0mL蒸餾水代替樣品液，加入5.00mL考馬斯亮藍(lán)溶液，其余操作同上，作空白對照。

1.2.3 雙水相系統(tǒng)相圖制作[10]

精確稱取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%、不同相對分子質(zhì)量的PEG于試管中，加入1g ddH2O，用滴定管緩慢滴加已配好的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%（NH4）2SO4溶液，并不斷在漩渦混合器上混合，觀察溶液的澄清程度，直至試管中溶液開始出現(xiàn)渾濁為止。記錄（NH4）2SO4的添加量（g）。然后加水，使其澄清，繼續(xù)向試管中滴加（NH4）2SO4溶液并不斷混勻，直至再次達(dá)到混濁，如此反復(fù)操作。計算每次達(dá)到渾濁時，PEG和（NH4）2SO4在系統(tǒng)總量中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（g/g），以PEG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)，（NH4）2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)作圖，即得到一條雙節(jié)線的相圖。

1.2.4 雙水相萃取方法

固定體系總質(zhì)量為10.00g，加入適量的PEG和（NH4）2SO4，充分振蕩使成相物質(zhì)溶解，同時完成了紅豆蛋白在雙水相系統(tǒng)中的分配過程，在一定條件下萃取。此雙水相系統(tǒng)靜置一定時間，當(dāng)兩相達(dá)到相分離，紅豆蛋白富集于雙水相系統(tǒng)的上相中，讀取上下相體積，求相比R；分別測定上下相蛋白質(zhì)濃度，計算紅豆蛋白的分配系數(shù)K及萃取率Y，如下式：

1.2.5 Plackett-Burman（PB）試驗設(shè)計

在前期試驗的基礎(chǔ)上，選取可能影響雙水相萃取蛋白質(zhì)的7個因素進(jìn)行Plackett-Burman設(shè)計，每個因子取高（+1）和低（-1）2個水平，響應(yīng)值為萃取率（Y）。試驗因素、水平及編碼見表1。

1.2.6 最陡爬坡試驗

響應(yīng)面擬合方程只有在考察是區(qū)域里才能充分近似真實情況，所以先逼近最大萃取率區(qū)域后才能建立有效的擬合方程。根據(jù)PB試驗篩選出顯著因子，進(jìn)行最陡爬坡試驗，以期尋找到最大萃取率。

1.2.7 響應(yīng)面分析

響應(yīng)曲面分析法（RSM）中的試驗設(shè)計（Box-Behnken）是一種尋找多因素系統(tǒng)中最佳條件的數(shù)學(xué)統(tǒng)計方法。本試驗利用Design-Expert 7.16數(shù)據(jù)處理軟件設(shè)計一個3因素3水平共17個試驗點(diǎn)的試驗，得到最佳的雙水相萃取條件，各因素及其水平見表2。

表1 Plackett-Burman 試驗設(shè)計因素水平范圍Table 1 Factors and levels in the Plackett-Burman design

表2 Box-Behnken 試驗因素與水平Table 2 Levels and factors of Box-Behnken experiment

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用紫外可見分光光度計測波長595nm處吸光度值，繪制蛋白總量-吸光度值標(biāo)準(zhǔn)曲線，以試管中牛血清白蛋白的總量（μg）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光度值（A）為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到其線性方程為y=0.0059x+0.0245（R2=0.9939）。

2.2 不同相對分子量PEG/（NH4）2SO4雙水相體系相圖

在室溫條件下，測定不同分子量PEG/（NH4）2SO4雙水相體系相圖，結(jié)果見圖1?？紤]到萃取是在兩相條件下進(jìn)行的，因此選擇在雙節(jié)線上方的質(zhì)量分?jǐn)?shù)點(diǎn)作為單因素的參考條件。

圖1 不同相對分子質(zhì)量PEG與(NH4)2SO4的雙水相相圖Fig.1 Phase diagram of different relative molecular mass PEG and(NH4)2SO4 in aqueous two-phase system

由圖1可知，當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時，隨著PEG相對分子質(zhì)量的增大，形成雙水相體系所需PEG的濃度降低。因為PEG相對分子質(zhì)量越大，其憎水程度越強(qiáng)，且加大與硫酸銨分相的動力，導(dǎo)致臨界分相濃度降低[11]。

2.3 雙水相系統(tǒng)中PEG相對分子質(zhì)量的確定

PEG/（NH4）2SO4雙水相體系中，在PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，室溫條件下萃取30min，改變PEG的分子量，比較雙水相體系中紅豆蛋白的分配情況，結(jié)果見圖2。

圖2 PEG相對分子質(zhì)量對紅豆蛋白質(zhì)分配行為的影響Fig.2 Effects of relative molecular of PEG on partitioning behaviour of red bean protein

由圖2可知，成相聚合物的相對分子質(zhì)量是影響分配平衡的重要因素，降低聚合物的相對分子質(zhì)量，則蛋白質(zhì)分配于富含該聚合物的相中。降低PEG的相對分子質(zhì)量，紅豆蛋白的分配系數(shù)和萃取率總體上呈現(xiàn)上升的趨勢，是因為PEG分子量減小時，其疏水性顯著減弱，使紅豆蛋白在上相的表面張力減小，從而易于向上相分配[12]。綜合考慮，5種PEG中，PEG2000的萃取效果最好，并且紅豆蛋白在PEG2000-（NH4）2SO4體系中的分配系數(shù)最高，故選PEG2000為雙水相系統(tǒng)成相物質(zhì)。

2.4 Plackett-Burman試驗設(shè)計影響因素水平

Plackett-Burman試驗設(shè)計結(jié)果見表3。

利用Design-Expert 7.16軟件對Plackett-Burman試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析，各因素的影響效果見表4。由表4可知，7種影響因子中，萃取pH值（C）、萃取溫度（D）、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)（E），對紅豆蛋白萃取率影響較大。其中，萃取pH值（C）、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)（E）對紅豆蛋白萃取率的影響是正效應(yīng)，萃取溫度（D）對紅豆蛋白萃取率的影響是負(fù)效應(yīng)。由此確定萃取pH值（C）、萃取溫度（D）、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)（E）3個因子對紅豆蛋白萃取率的影響最為顯著。不顯著因素表現(xiàn)為正效應(yīng)的取高水平，表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)的取低水平。

2.5 最陡爬坡試驗

由表4的Plackett-Burman試驗設(shè)計結(jié)果分析表明，萃取pH值、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對紅豆蛋白萃取率的影響是正效應(yīng)，應(yīng)增加。萃取溫度對紅豆蛋白萃取率的影響是負(fù)效應(yīng)，應(yīng)降低。根據(jù)Plackett-Burman法篩選出的顯著因子效應(yīng)大小設(shè)計其的步長，進(jìn)行最陡爬坡試驗，以期尋找到最優(yōu)萃取條件。其他因素選用Plackett-Burman試驗中1和-1水平的平均值[13-15]。本試驗采用Plackett-Burman法進(jìn)行試驗設(shè)計，試驗設(shè)計和結(jié)果見表5。

表3 Plackett-Burman 試驗設(shè)計結(jié)果Table 3 Results of Plackett-Burman design

表4 PB 實驗參數(shù)估計Table 4 Coefficient estimates of variables in PB design

表5 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果Table5 Design and results of steepest ascent experiment

由試驗結(jié)果可以看出，隨著3種關(guān)鍵因子的變化，紅豆蛋白萃取率先上升后下降，在試驗3的組合下紅豆蛋白萃取率最大，因此選擇該組合作為中心組合設(shè)計的0水平值進(jìn)行下一步的優(yōu)化試驗設(shè)計，即萃取pH值、萃取溫度、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)，分別為7.4、32℃、0.15%。

2.6 Box-Behnken試驗

2.6.1 Box-Benhnken試驗設(shè)計

根據(jù)最陡爬坡確定的試驗因素中心點(diǎn)，采用Box-Behnken設(shè)計對雙水相萃取紅豆蛋白質(zhì)條件進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化，其設(shè)計及結(jié)果見表6。

表6 Box-Behnken 試驗設(shè)計與結(jié)果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiment

2.6.2 Box-Benhnken試驗數(shù)據(jù)分析

表7 Box-Behnken 試驗結(jié)果的回歸分析Table 7 Regression analysis of Box-Behnken experiment results

以紅豆蛋白萃取率Y為響應(yīng)值，根據(jù)表6的試驗結(jié)果，用Design-Expert8.0.5.0軟件進(jìn)行多元回歸分析，具體結(jié)果見表7。經(jīng)回歸擬合后，試驗因子對響應(yīng)值的影響可用以下回歸方程表示：

方差分析顯著性檢驗表明，R2=92.62%，方程回歸性顯著。分析結(jié)果見表7。

對該模型進(jìn)行方差分析，該模型X2、X12、X22對響應(yīng)值的影響顯著，說明萃取溫度對響應(yīng)值的影響顯著。在所選取的各因素水平范圍內(nèi)，按照對結(jié)果的影響排序：萃取溫度＞萃取pH值＞NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)。本模型擬合程度明顯，失擬項p=0.2372，沒有顯著性意義。從而證明該模型的擬合是合適的。對該模型進(jìn)行可信度分析，R2=0.9262，說明該模型能解釋響應(yīng)值變化的92.62%，模型擬合程度好。

2.6.3 顯著因素水平的優(yōu)化

利用Design-Expert8.0.5.0軟件根據(jù)回歸方程進(jìn)行響應(yīng)面分析，繪制響應(yīng)面圖和等高線圖，結(jié)果見圖3，每個響應(yīng)面分析圖分別代表著兩個因素之間的的交互情況。由圖3可知，響應(yīng)面變量Y有最大值，即X1、X2和X3存在極值點(diǎn)。

此回歸模型得出Box-Benhnken試驗的最佳萃取條件為萃取pH值為7.5，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.145%，萃取溫度為33℃，紅豆蛋白萃取率的理論值為49.54%。

2.6.4 驗證試驗

為檢測模型與試驗結(jié)果是否一致，根據(jù)以上確定的萃取條件進(jìn)行3組試驗驗證，得到紅豆蛋白萃取率為50.27%，與預(yù)測值49.54%基本一致，說明該方法與實際情況擬合很好，充分驗證了所建模型的正確性，說明響應(yīng)面法適用于對紅豆蛋白萃取工藝進(jìn)行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。

3 結(jié)論

采用Plackett-Burman設(shè)計、最陡爬坡試驗、響應(yīng)面法，確定雙水相體系組成為PEG2000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%、（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%、pH值為7.5、萃取溫度33℃、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.145%時，紅豆蛋白質(zhì)萃取率可達(dá)50.27%。因此，利用響應(yīng)面分析方法對紅豆蛋白質(zhì)的萃取條件進(jìn)行優(yōu)化，可以獲得最優(yōu)的工藝參數(shù)，能有效的減少工藝操作的盲目性，從而為進(jìn)一步的試驗研究奠定基礎(chǔ)。

圖3 各因素交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.3 Response surface and contour plots of effect of interaction between every two factors on the yield of red bean protein

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