淫羊藿葉多糖的超聲輔助提取工藝研究

劉曉鵬，姜 寧 *，劉志彪

（1.湖北民族學院 科技學院，湖北 恩施 445000；2.湖北民族學院 生物科學與技術學院，湖北 恩施 445000）

淫羊藿屬小蘗科（Berberidaceae）淫羊藿屬（Epimedium）植物，主要分布于亞洲、中東、和歐洲的溫帶和亞熱帶地區(qū)，其中80%分布在中國，一般生長在林下、灌木叢中或陰濕的地方，海拔200m～3700m之間的地區(qū)。中國藥典2005版、2010版均收載該植物為藥用植物[1]，2010版《中國藥典》一部中有龜鹿補腎丸、抗骨增生丸、抗骨增生膠囊等多個常用中成藥的主要原料藥均含淫羊藿[1]。

淫羊藿屬植物的化學成分主要為黃酮類、多糖、木脂素類、酚苷類、紫羅酮類、倍半萜類、苯乙醇苷類、生物堿類等；淫羊藿多糖具有激活巨噬細胞T和B淋巴細胞以及網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)、促進干擾素的合成、增強機體抗菌、抗腫瘤、降低血糖和血脂、抗衰老、抗艾滋病病毒（HIV）、抗疲勞、抗凝血、消除自由基、抗動脈粥樣硬化以及恢復機體放化療后的免疫功能等藥理作用，可增強機體免疫力、增強造血功能和調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等功效[2-3]。傳統(tǒng)的中藥中，對淫羊藿葉多糖的提取方法是以水煎劑形式的水提法，其提取結(jié)果成分不明確，有效成分含量含糊不清。進行淫羊藿葉多糖的提取研究是進一步明確淫羊藿葉多糖的組成、結(jié)構(gòu)及功能的基礎。本研究對淫羊藿葉多糖超聲提取的方法進行了研究，為進一步對該成分進行藥理研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

淫羊藿葉：由恩施隆鑫中藥材公司提供，60℃烘干，粉碎，過60目篩；標準葡萄糖、蒽酮、正丁醇、95%vol乙醇為分析純，濃硫酸、氯仿為化學純。

1.2 儀器

JY96-Ⅱ超聲波細胞粉碎機；紫外分光光度計；水浴鍋；離心機等。

1.3 方法

1.3.1 水浴提取淫羊藿葉多糖

采用正交試驗水浴提取淫羊藿葉多糖，選取影響水浴提取效果的4個因素：料液比、水浴溫度、水浴時間、pH值，設計4因素3水平的正交試驗，采用L9（34）正交表，試驗數(shù)為9（試驗設計水平表見表1）。

稱取1g淫羊藿干粉，加入不同pH值的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液或磷酸緩沖液，按不同因素水平水浴提取，然后離心取上清液，加入3倍體積的乙醇，靜置于4℃冰箱2h；離心（轉(zhuǎn)速5000r/min，時間10min），取沉淀，加10mL蒸餾水溶解；Sevag法除蛋白，取上清液，加水稀釋5倍。取樣，用蒽酮比色法測量淫羊藿葉多糖的含量。

表1 水浴提取因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal extracting test for polysaccharides extraction

1.3.2 超聲輔助提取淫羊藿葉多糖

稱取1g淫羊藿干粉，加入不同pH值的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液或磷酸緩沖液，進行超聲波處理，離心取上清液，加3倍體積的乙醇，靜置于4℃冰箱中24h；離心（轉(zhuǎn)速5000r/min，時間10min），取沉淀，加10mL蒸餾水溶解；Sevag法除蛋白，取上清液，加水稀釋5倍。取樣用硫酸-蒽酮比色法[4]測量淫羊藿葉多糖的含量。

選取不同的超聲波功率：40W、60W、80W、100W、120W進行單因素試驗，超聲時間30min，料液比1∶80，pH8.0進行單因素試驗，多糖的測定按1.3.2的方法進行。試驗重復3次。

選取不同的超聲時間：10min、20min、30min、40min進行單因素試驗，超聲功率是60W、料液比1∶80，pH8.0進行單因素試驗，多糖的測定按1.3.2的方法進行。試驗重復3次。

選取不同的料液比：1∶20、1∶40、1∶60、1∶80進行單因素試驗，超聲功率60W、時間30min，pH8.0進行單因素試驗，多糖的測定按1.3.2的方法進行。試驗重復3次。

選取不同的pH值：5.5、6.0、7.0、8.0、8.5進行單因素試驗，超聲功率60W、時間30min，料液比1∶80進行單因素試驗，多糖的測定按1.3.2的方法進行。試驗重復3次。

為了綜合研究以上4個因素對淫羊藿葉多糖提取效果的影響，設計了4因素3水平的正交試驗，試驗設計見表2。

表2 超聲輔助提取因素水平Table 2 Factors and levels of orthogonal extracting test for polysaccharides extraction by ultrasonic-assisted

1.3.3 超聲輔助提取淫羊藿葉多糖與水浴提取效果的比較

根據(jù)正交試驗與單因素試驗結(jié)果，分別選取超聲輔助提取的最佳工藝與水浴提取的最佳工藝進行淫羊藿葉多糖的提取，每個試驗重復10次以比較二者的提取效果。試驗結(jié)果用SPSS 16.0 軟件包分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水浴提取淫羊藿葉多糖的結(jié)果與分析

由水浴提取淫羊藿葉多糖正交試驗結(jié)果得知（表3）：4個影響水浴提取因素的主次順序為料液比＞水浴溫度＞pH值＞水浴時間；水浴提取淫羊藿葉多糖的最佳工藝是A3B1C2D3，即料液比為1∶80、水浴時間60min、水浴溫度80℃、浸出液的pH值為8.0。

表3 水浴提取淫羊藿葉多糖正交試驗結(jié)果Table 3 Result of orthogonal extracting test for polysaccharides extraction by hot water

表4 水浴提取淫羊藿葉多糖正交試驗結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal extracting test for polysaccharides extraction by hot water

對水浴提取淫羊藿葉多糖正交試驗結(jié)果進行方差分析（表4），結(jié)果表明，料液比、時間、溫度和pH值這4個因素的F值分別為211.721、6.063、32.384和7.970，顯著水平均達到p＜0.05，說明這4個因素均能顯著影響試驗結(jié)果。比較4個因素的F值，同樣可以得出各因素的主次順序料液比＞水浴溫度＞pH值＞水浴時間，這與上述分析一致。

2.2 超聲輔助提取淫羊藿葉多糖的結(jié)果與分析

2.2.1 超聲功率單因素試驗結(jié)果與分析

超聲功率單因素試驗結(jié)果（表5）表明，當超聲功率為100W時，淫羊藿葉多糖提取率平均達2.25%，為最高值，隨著超聲功率進一步加大，多糖的提取率不再升高反而下降。對該試驗結(jié)果進行方差分析（表6），F(xiàn) crit為顯著水平達0.05時的F臨界值，即F0.05（4，10），由于F＞F crit，可以看出超聲輔助有助于淫羊藿葉多糖的提取。

表5 超聲功率單因素試驗結(jié)果Table 5 Result of single factor test on the ultrasonic intensity

表6 超聲功率單因素試驗結(jié)果方差分析Table 6 Variance analysis of single factor test on the ultrasonic intensity

2.2.2 超聲時間單因素試驗結(jié)果與分析

從超聲時間單因素試驗結(jié)果（表7）可知，當超聲時間從10min延長至20min時，超聲輔助提取淫羊藿葉多糖的量并未顯著增加，當從20min延長至30min時，多糖提取量增加顯著，當超聲時間進一步延長時，多糖提取的數(shù)量又開始下降。對超聲單因素試驗結(jié)果進行方差分析（表8），可以得知F.＞F crit，也就是大于顯著水平為0.05時的F臨界值，表明超聲時間這個因素對淫羊藿葉多糖提取的影響達顯著水平。

表7 超聲時間單因素試驗結(jié)果Table 7 Result of single factor test on the ultrasonic time

2.2.3 料液比單因素試驗結(jié)果與分析

表9的料液比單因素試驗結(jié)果表明，雖然料液比為1∶80時多糖含量最高，但用LSD法對不同料液比處理間的進行差異顯著性分析，發(fā)現(xiàn)料液比1∶80與1∶60時無顯著差異，所以最佳料液比應為1∶60；方差分析（表10）結(jié)果表明，F(xiàn)值大于顯著水平為0.05時的F臨界值（F crit），說明料液比能顯著影響超聲輔助提取淫羊藿葉多糖的得率。

表8 超聲時間單因素試驗結(jié)果方差分析Table 8 Variance analysis of single factor test on the ultrasonic time

表9 料液比單因素試驗結(jié)果Table 9 Result of single factor test on the material/liquid ratio

表10 料液比單因素試驗結(jié)果方差分析Table 10 Variance analysis of single factor test on the material/liquid ratio

2.2.4 pH值單因素試驗結(jié)果與分析

從表11的pH值單因素試驗結(jié)果可以看出，浸提液在酸性至中性的范圍內(nèi)，超聲輔助提取淫羊藿葉多糖的得率逐步增大，當浸出液為微堿性時（pH8.0），多糖的得率為最大值；當浸出液pH值為8.5時，多糖的得率開始下降。對該數(shù)據(jù)的方差分析（表12）表明，F(xiàn)＞F crit（顯著水平為0.05時的F臨界值），也就是說pH值這個因素對超聲輔助提取淫羊藿葉多糖的得率會產(chǎn)生顯著的影響。

表11 pH 值單因素試驗結(jié)果Table 11 Result of single factor test on the pH value

2.2.5 超聲輔助提取淫羊藿葉多糖的正交試驗結(jié)果分析

超聲輔助提取淫羊藿葉多糖的正交試驗結(jié)果（表13）表明，各因素對超聲輔助提取淫羊藿葉多糖影響的主次順序為A＞D＞B＞C，最優(yōu)提取工藝是A2B3C1D2，也就是料液比1∶60、超聲功率100W、超聲時間10min、pH7.0。對此提取工藝進行驗證，試驗重復10次，淫羊藿葉多糖的得率平均為2.27%。

表12 pH 值單因素試驗結(jié)果方差分析Table 12 Variance analysis of single factor test on the pH value

表13 超聲輔助提取淫羊藿葉多糖正交試驗結(jié)果Table 13 Result of orthogonal test for polysaccharides extraction by ultrasonic-assisted

表14為超聲輔助提取淫羊藿葉多糖正交試驗結(jié)果的方差分析，從表14可以看出，料液比、超聲功率、超聲時間和pH值4個因素對提取結(jié)果的影響均達到顯著水平（p＜0.05），從它們的F值同樣可以得出如下結(jié)論：超聲輔助提取淫羊藿葉多糖影響因素的主次順序為料液比＞pH值＞超聲功率＞超聲時間。

表14 超聲輔助提取淫羊藿葉多糖正交試驗結(jié)果方差分析Table 14 Variance analysis of orthogonal test for polysaccharides extraction by ultrasonic-assisted

2.3 超聲輔助提取淫羊藿葉多糖與水浴提取淫羊藿葉多糖效果的比較結(jié)果與分析

超聲輔助提取淫羊藿葉多糖采用通過單因素試驗與正交試驗結(jié)果分析得出的最佳工藝：料液比1∶60、超聲功率100W、超聲時間10min、浸提液的pH7.0；水浴提取淫羊藿葉多糖采用通過正交試驗結(jié)果分析得出的最佳工藝：料液比1∶80、水浴時間60min、水浴溫度80℃、浸出液的pH值為8.0。每個試驗重復10次，結(jié)果為超聲輔助提取淫羊藿葉多糖的得率為2.27%，而水浴提取為1.34%，多糖得率提高了68.70%。對試驗數(shù)據(jù)進行t檢驗，兩組數(shù)據(jù)的差異顯著水平達0.01。說明了超聲輔助法提取淫羊藿葉多糖明顯優(yōu)于水浴法。

3 討論

通過超聲處理，淫羊藿葉細胞破裂，而且超聲波還具有機械振動、乳化擴散、擊碎等效應，有利于植物中有效成分的轉(zhuǎn)移、擴散，這就使胞內(nèi)多糖較水浴浸提的釋放量要多得多，加大料液比可以提高多糖浸出的濃度差，使多糖盡快溶入浸出液中[5]。超聲功率與超聲處理時間的摸索，是為了研究最適合淫羊藿細胞破裂的超聲處理條件。

超聲輔助提取淫羊藿葉多糖的單因素試驗表明：超聲功率、超聲時間、料液比、浸出液的pH值這4個因素對多糖提取效果均產(chǎn)生顯著影響，說明在超聲輔助提取淫羊藿葉多糖的工藝摸索中必須對這4個因素都應加以考慮。試驗結(jié)果表明，超聲功率為100W時就能使細胞最大程度的破裂，提高功率對提高得率并無幫助；在單因素試驗中超聲波處理時間以30min為最優(yōu)，最佳的pH值為8.0，而在正交試驗中超聲波處理時間以10min為最優(yōu)，最佳的pH值為8.0，說明4個因素需要優(yōu)化組合才能得到最優(yōu)的淫羊藿葉多糖提取工藝。

通過2種方法的比較試驗證明了超聲輔助提取淫羊藿葉多糖明顯優(yōu)于水浴提取，多糖的得率提高了68.70%，并且超聲處理還具有省時（從60min縮短為10min）、節(jié)能等優(yōu)點。這為工業(yè)化大生產(chǎn)提取淫羊藿葉多糖提供了有利的理論依據(jù)。

[1]中國藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

[2]孟 坤，劉冠中.天然藥物淫羊藿和巴戟天的免疫調(diào)節(jié)作用研究進展[J].中國醫(yī)藥學報，2003，18（8）：493-495.

[3]李作洲，徐艷琴，王 瑛，等.淫羊藿屬藥用植物的研究現(xiàn)狀與展望[J].中草藥，2005，36（2）：289-295.

[4]常艷旭，李 晉，蘇格爾.鎖陽不同生育期多糖含量的動態(tài)研究[J].內(nèi)蒙古大學學報：自然科學版，2007，2（38）：237-240.

[5]姜 峰，趙燕禹，姜梅蘭，等.功率超聲在中藥提取過程中的應用[J].化工進展，2007，26（7）：944-948.