大蒜素對兔心房肌細(xì)胞超速激活延遲整流鉀電流的作用

陳 晨, 王 禹, 張德賢, 傅義程, 陳 曦, 徐 斌, 楊 潔, 尹 彤, 朱慶磊,李 泱

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大蒜素對兔心房肌細(xì)胞超速激活延遲整流鉀電流的作用

陳 晨, 王 禹, 張德賢, 傅義程, 陳 曦, 徐 斌, 楊 潔, 尹 彤, 朱慶磊,李 泱*

（解放軍總醫(yī)院老年心血管病研究所, 北京 100853）

研究大蒜素對兔單個心房肌細(xì)胞超速激活的延遲整流鉀電流（KUr）的作用，探討其抗房性心律失常的機(jī)制。采用雙酶法分離兔單個心房肌細(xì)胞，應(yīng)用細(xì)胞外局部灌流法給藥，采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄電流，以觀察大蒜素對KUr的作用。大蒜素200μmol/L對正常兔心房肌細(xì)胞KUr有顯著的抑制效應(yīng)，使KUr峰值由（14.5±3.2）pA/pF降至（7.9±1.2）pA/pF (＜0.01，＝15）。大蒜素可使KUr的電流-電壓曲線降低，且隨著除極化電位的增加，作用更加明顯，提示其作用具有電壓依賴性。同時，發(fā)現(xiàn)大蒜素對KUr的抑制效應(yīng)存在濃度依賴性，半數(shù)抑制濃度（IC50）為149.6μmol/L。門控動力學(xué)機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素可以使通道激活曲線右移，延遲激活；使通道穩(wěn)態(tài)失活左移，加速失活；使通道失活后恢復(fù)時間延長，減緩?fù)ǖ朗Щ詈蟮脑俅渭せ?。從不同環(huán)節(jié)減少KUr通道的開放，降低電流密度。大蒜素抑制心房肌細(xì)胞膜上KUr，這可能是其治療房性心律失常的細(xì)胞電生理基礎(chǔ)。

大蒜素; 心房肌細(xì)胞; 超速激活延遲整流鉀電流; 膜片鉗技術(shù)

房性心律失常，特別是心房顫動（atrial fibrillation，AF），已成為最常見的心律失常之一。可引起腦卒中、肺栓塞、心力衰竭、心肌梗死等諸多并發(fā)癥，有著很高的病死率和致殘率[1]。盡管目前有很多藥物正應(yīng)用于AF的治療，但是人們?nèi)韵Ｍ玫揭环N更為安全而有效的抗心律失常藥物[2]。理想的治療AF的藥物應(yīng)具有高度的心房肌細(xì)胞選擇性，可以選擇性地終止或延緩AF的發(fā)生，而不引起室性心律失常。超速激活的延遲整流鉀電流（the ultra rapid delayed rectifier potassium current，KUr）只存在于心房肌細(xì)胞膜上，而在心室肌無分布，故是構(gòu)成心房肌細(xì)胞復(fù)極化電流的主要成分之一，也是治療房性心律失常的電位靶點(diǎn)[3]。

大蒜素（allitridum，All）是一種從百合科植物大蒜鱗莖中分離出的具有多種生物學(xué)活性的化合物，其化學(xué)名為二烯丙基三硫化物。近年來，All在防治心血管疾病領(lǐng)域的研究受到重視，已證實其有減慢竇率、抑制心肌收縮、抗心律失常等作用，能拮抗多種模型動物的實驗性心律失常。資料顯示，All具有明顯的抗房性心律失常的效應(yīng)，但作用機(jī)制尚不明確[4]。本研究選擇兔心房肌細(xì)胞，用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察All對兔心房肌細(xì)胞KUr的影響，以闡明All的抗AF等房性心律失常作用的細(xì)胞電生理基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 溶液與試劑

膠原酶Ⅱ、胰蛋白酶、牛血清白蛋白、天冬氨酸鉀、丙酮酸鈉、MgATP、HEPES、CaCl2、CdCl2、BaCl2、4-氨基吡啶（4-aminopyridine，4-AP）、dofeilite均為Sigma公司產(chǎn)品；EGTA購自Fluka Biochemika；其他試劑均為分析純。Tyrode液的組成成分（mmol/L）：NaCl 135，KCl 5.4，CaCl21.8，MgCl21.0，NaH2PO40.33，HEPES 10，glucose 10，pH值用NaOH調(diào)至7.3；無鈣Tyrode液和0.2mmol/L Ca2+Tyrode液，分別為Tyrode液中不加CaCl2和加0.2 mmol/LCaCl2。細(xì)胞保護(hù)液（KB液，mmol/L）：KOH 110，taurine 10，oxalic acid 10，glutamic acid 70，KCl 25，KH2PO410，EGTA 5，Hepe 5，glucose 10，以KOH調(diào)pH值至7.4。細(xì)胞外液（mmol/L）：N-methyl-D-glucamine（NMG）149，MgCl25，CaCl20.65，HEPES 5，以HCl調(diào)pH值至7.4。細(xì)胞內(nèi)液（mmol/L）：KCl 45，K-aspartate 85，Na-pytuvate 5，MgATP 5.0，EGTA 10，HEPES 10，glucose 11，用KOH調(diào)pH值至7.4。

1.2 兔單個心房肌細(xì)胞分離

成年新西蘭兔（1.0～1.5kg），雌雄兼有。購自解放軍總醫(yī)院實驗動物中心，動物實驗方法符合動物倫理學(xué)要求。依據(jù)文獻(xiàn)[5]采用酶解法制備心房肌單細(xì)胞并進(jìn)行了改進(jìn)。實驗兔經(jīng)腹腔20%水合氯醛（2ml/kg）麻醉，迅速取心臟，在37℃和通氧條件下行Langendorff 灌流。用無Ca2+Tyrode￠s液灌流3～5min，用含Ⅱ型膠原酶70mg、胰蛋白酶12mg無Ca2+Tyrode￠s液灌流（50ml）25～30min以消化心房肌。沿房室間溝取心房肌，剪碎后加入KB液中并吹打使細(xì)胞脫落，并于-4℃保存，1h后進(jìn)行實驗。取保存液加于1ml灌流槽中，待細(xì)胞貼壁后，于倒置顯微鏡下選擇邊緣整齊、表面無顆粒、橫紋清晰、無收縮的細(xì)胞，在37℃下進(jìn)行實驗。

1.3 藥物及應(yīng)用

All（化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1）購于上海禾風(fēng)制藥有限公司，純品是無色或淡黃色油狀物，相對分子質(zhì)量為162。臨用時采用細(xì)胞外液新鮮配制成結(jié)果中所示終濃度。采用局部灌流裝置于細(xì)胞外恒流灌流方式給藥，為確保藥物效應(yīng)的一致性，待平衡5min后方可記錄電流。

圖1 All的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

Figure 1 Chemical structural formula of allitridum

1.4 干擾電流的排除

向細(xì)胞外液加入BaCl2200μmol/L阻斷K1，加入dofeilite 5nmol/L阻斷Kr，CdCl2100μmol/L阻斷Ca,L，TTX 100μmol/L阻斷Na。參照文獻(xiàn)[6]采用電流減除法消除to干擾。

1.5 全細(xì)胞膜片鉗記錄

采用全細(xì)胞膜片鉗記錄方法，在電流鉗模式下記錄動作電位；在電壓鉗制下記錄電流。膜片鉗放大器（AXON-700B，USA）同計算機(jī)連接。刺激信號及電壓輸入信號的采集通過Digidata1440A數(shù)模轉(zhuǎn)換器由軟件（pCLAMP）控制。玻璃毛坯（GG-17）經(jīng)微電極拉制儀（Narishige，pp-83）拉制成電阻為2.5～5.5MΩ的電極。調(diào)節(jié)三維操縱器進(jìn)行封接，使封接電阻達(dá)1GΩ以上，吸破細(xì)胞膜形成全細(xì)胞記錄模式。細(xì)胞膜電容記錄：施以0.4V/s的斜坡刺激，記錄電流并按方程Cm＝/（dV/dt）計算細(xì)胞膜電容Cm，其中為電流值，dV/dt即電壓斜率。為消除細(xì)胞間誤差，電流值以電流密度（pA/pF）表示。慢電容及串聯(lián)電流補(bǔ)償為85%～90%。信號經(jīng)截止頻率為1kHz的四階貝塞爾低通濾波器濾波，采樣率為5kHz。

1.6 參數(shù)的設(shè)定

KUr的電流：保持電位-80mV，施予-40mV，20ms的預(yù)刺激失活鈉通道，隨即給予+50mV，2000ms的脈沖，記錄KUr。

KUr電流-電壓曲線：保持電位-80mV，施予-40mV，20ms的預(yù)刺激失活鈉通道，隨即給予-40mV～+70mV，2000ms的脈沖，記錄KUr。以電流密度與測試電壓作圖，得到KUr的電流-電壓曲線。

KUr穩(wěn)態(tài)激活曲線：保持電位-80mV，施予-40mV，20ms的預(yù)刺激失活鈉通道，隨即給予-40mV～+70mV，4000ms的脈沖，記錄KUr。標(biāo)準(zhǔn)化各電流幅值，以相對電流對各膜電位作圖得到穩(wěn)態(tài)激活曲線，并用Boltzmann方程“/max＝{1+exp[(1/2,act-m)/act]}-1”進(jìn)行曲線擬合，其中1/2為半激活電壓，為激活曲線斜率。

KUr穩(wěn)態(tài)失活曲線：采用典型的雙刺激模式，保持電位-80mV，施予-40mV，20ms的預(yù)刺激失活鈉通道，緊接著給予+60mV，5000ms的條件刺激，緊接著給予-40～+50mV，階躍5mV的系列測試刺激，記錄殘存KUr。標(biāo)準(zhǔn)化各電流幅值，以相對電流對各膜電位作圖得穩(wěn)態(tài)失活曲線。用Boltzmann方程“/max＝{1+exp[-（1/2,inact-m）/]}-1”進(jìn)行曲線擬合求出半失活電壓（1/2）和曲線斜率（inact）。

KUr失活后恢復(fù)曲線：采用典型的雙刺激模式，保持電位-80mV，施予-40mV，20ms的預(yù)刺激失活鈉通道，緊接著給予+60mV，2000ms的條件刺激，間隔100，200，300，400，500，600，700，800ms，給予+60mV，2000ms的測試刺激，記錄KUr。標(biāo)準(zhǔn)化各電流幅值，以相對電流對間隔時間作圖，得失活后恢復(fù)曲線。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 All對心房肌IKUr峰值電流密度的作用

正常的急性分離的兔心房肌細(xì)胞KUr電流密度為（14.5±2.2）pA/pF，該電流對4-AP敏感，100μmol/L的4-AP幾乎可以將其阻斷。應(yīng)用200μmol/L的All后可使其電流密度明顯降至（9.9±1.2）pA/pF（＜0.01，＝15）。給予50，100，200，400μmol/L的All后發(fā)現(xiàn)藥物的抑制效應(yīng)隨著濃度增加而增強(qiáng)，呈現(xiàn)出濃度依賴性特征，半數(shù)抑制濃度（IC50）為149μmol/L，Hill系數(shù)為0.71（圖2）。

2.2 All對心房肌IKUr電流-電壓曲線的作用

隨著電壓向除極化方向增加，電流密度增大，且呈一定的外整流特征。當(dāng)細(xì)胞暴露于All 200μmol/L時，KUr在正于＋10mV的各電壓下電流密度明顯降低，隨著電壓向除極化的方向移動，這種效應(yīng)更加明顯。電流的外向整流特征也相對降低，用藥后的KUr電流-電壓曲線近乎直線（圖3）。

圖2 All對心房肌細(xì)胞IKUr電流的濃度依賴性作用

Figure 2 Concentration-dependent effect of allitridum on atrial myocytesKUrcurrent

A: 對KUr作用原始電流圖(＋50mV); B: 對KUr峰值的作用; C: 對KUr作用的濃度依賴性。與對照組比較,P＜0.01

圖3 All對心房肌細(xì)胞IKUr電流-電壓曲線的作用

Figure 3 Effect of allitridum on atrial myocytesKUrcurrent-voltage curve

A: 對KUr作用原始電流圖; B: I-曲線。與對照組比較,P＜0.05,P＜0.01

2.3 All對心房肌細(xì)胞IKUr激活曲線的作用

與對照細(xì)胞的電流比較，應(yīng)用All 200μmol/L后，KUr的穩(wěn)態(tài)激活曲線右移，即向除極化方向移動，1/2,act從對照的（-13.67±1.24）mV正移到（-2.38±0.11）mV（＝14，＜0.01），且激活曲線斜率act也有降低，在用藥前后分別為（10.32±0.94）mV和（6.21±0.57）mV（＝14，＜0.01；圖4）。

2.4 All對心房肌細(xì)胞IKUr失活曲線的作用

如圖5所示，應(yīng)用All 200μmol/L后，KUr的失活曲線左移，即向超極化方向移動，1/2,inact從對照的（-6.32±0.46）mV移到（-12.67±1.11）mV（＝14，＜0.01），但藥物對穩(wěn)態(tài)失活曲線斜率inact影響不大。

2.5 All對心房肌IKUr失活后恢復(fù)動力學(xué)的作用

標(biāo)準(zhǔn)化各電流幅值，以相對電流對間隔時間作圖，得到失活后恢復(fù)曲線，由圖6可見，All 200μmol/L可使恢復(fù)曲線明顯減慢，此現(xiàn)象在恢復(fù)的前400ms表現(xiàn)尤甚，恢復(fù)時間常數(shù)τ從對照的（134.6±13.9）ms移到（215.8±13.6）ms（＝14，＜0.01）。提示，在同一時間間隔下，通道恢復(fù)速率降低，電流幅值減少。

3 討 論

KUr是一種僅在心房肌細(xì)胞特異表達(dá)的離子通道電流，主要是心房肌細(xì)胞復(fù)極Ⅱ期的外向離子流，可促進(jìn)動作電位3期復(fù)極，是有效不應(yīng)期和動作電位時限的決定因素之一[7]。同時KUr對信號傳遞、心肌細(xì)胞興奮性、不應(yīng)性、傳導(dǎo)性穩(wěn)態(tài)的維持有重要作用。KUr出現(xiàn)異常是AF時心房肌電重構(gòu)的重要特征，因此也成為研究AF發(fā)生機(jī)制的關(guān)鍵指標(biāo)和治療房性心律失常的電位靶點(diǎn)[8,9]。目前，一系列的KUr阻滯劑治療AF的療效正在評估中[10]。

圖4 All對H2O2致兔心房肌細(xì)胞IKUr激活曲線改變的作用

Figure 4 Effect of allitridum on H2O2-induced change of rabbit atrial myocytesKUractivation curve

A: 對KUr穩(wěn)態(tài)激活曲線的作用; B: 對KUr半激活電壓的作用; C: 對KUr激活曲線斜率的作用。與對照組比較,P＜0.05,P＜0.01

本研究通過All對兔單個心房肌細(xì)胞KUr的效應(yīng)觀察，發(fā)現(xiàn)All可直接抑制KUr，使其峰值顯著降低。而且，此抑制作用存在電壓依賴性，即隨著除極化電位的增加，作用更加明顯。同時發(fā)現(xiàn)All對KUr的抑制效應(yīng)存在濃度依賴性。進(jìn)一步的門控動力學(xué)機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，All可以使通道激活曲線右移，延遲激活；使通道穩(wěn)態(tài)失活左移，加速失活；使通道失活后恢復(fù)時間延長，減緩?fù)ǖ朗Щ詈蟮脑俅渭せ?。從不同環(huán)節(jié)減少通道的開放，這可能是其降低KUr電流密度的主要機(jī)制。之前學(xué)者已證實All具有拮抗多種模型動物的實驗性心律失常的效應(yīng)，并發(fā)現(xiàn)其可降低心房自律性、興奮性，延長有效不應(yīng)期及收縮性，減慢房室傳導(dǎo)。本研究的結(jié)果至少可以從細(xì)胞水平部分地揭示All抗房性快速心律失?；駻F的電生理機(jī)制。

然而，研究心肌細(xì)胞KUr通道阻滯劑的效應(yīng)性較為復(fù)雜。首先，KUr與其他電流特別是瞬時外向鉀電流（to）有潛在的重疊，如何區(qū)分則顯得十分重要，本研究采用了電流減除法消除to干擾，以求結(jié)果反映真實客觀情況。其次，尚無選擇性的特異工具藥可供選擇，但其對4-AP較其他鉀電流敏感得多，已有不少實驗應(yīng)用4-AP作為鑒定該電流的工具藥。最后，還有各種疾病可引起KUr的電重塑[11]，故本研究雖然發(fā)現(xiàn)All對正常心房肌細(xì)胞KUr具有電壓依賴性和濃度依賴性阻滯效應(yīng)以及可能的門控機(jī)制，但是否與對AF時KUr的作用一致還有待進(jìn)一步的實驗加以證實。

在過去的十年中，對KUr阻滯劑的研究迅速開展。諸多KUr的阻滯藥已被證實在AF動物模型中有很好的療效[12-14]。Ford等[15]發(fā)現(xiàn)XEN-D0101通過對心房肌細(xì)胞KUr等電流的抑制發(fā)揮治療慢性AF作用。對新的KUr阻滯劑治療AF的評價顯示，單純的阻斷KUr通道不足以抑制AF。多數(shù)藥物在作用于KUr的同時還作用于其他通道[16]。文獻(xiàn)報道All還有抑制Na、Ca,L和其他鉀通道電流的作用。因此，我們認(rèn)為All通過抑制KUr及聯(lián)合其他通道的多重效應(yīng)而發(fā)揮其抗房性心律失常的作用。

圖5 All對兔心房肌細(xì)胞IKUr失活曲線的作用

Figure 5 Effect of allitridum on rabbit atrial myocytesKUrinactivation curve

A: 對KUr穩(wěn)態(tài)失活曲線的作用; B: 對KUr半失活電壓的作用; C: 對KUr失活曲線斜率的作用。與對照組比較,P＜0.01

圖6 All對兔心房肌細(xì)胞IKUr失活恢復(fù)動力學(xué)的影響

Figure 6 Effect of allitridum on rabbit atrial myocytesKUrrecovery from inactivation

A: 對KUr失活后恢復(fù)作用的原始記錄; B: 對KUr恢復(fù)動力學(xué)曲線的作用

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（編輯: 王雪萍）

Effects of allitridum on ultra rapid delayed rectifier potassium current in rabbit atrial cardiomyocytes

CHEN Chen, WANG Yu, ZHANG De-Xian, FU Yi-Cheng, CHEN Xi, XU Bin, YANG Jie, YIN Tong, ZHU Qing-Lei, LI Yang*

(Institute of Geriatric Cardiology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China)

To determine the effect of allitridum on the ultra rapid delayed rectifier potassium current (KUr) in single rabbit atrial cardiomyocyte, and investigate the mechanism of its anti-atrial arrhythmia.The dual enzymatic method was used to separate single rabbit atrial cardiomyocyte. The drug was appliedextracellular supserfusion, and current was evoked and recorded using Axon MultiClamp 700B amplifier.Allitridum at 200μmol/L exerted obvious inhibitory effect onKUrin normal rabbit atrial cardiomyocyte, and decreased the peak value from (14.5±3.2) to (7.9±1.2)pA/pF (＜0.01,＝15). Allitridum also resulted in a decrease in current-voltage curve, and the effect became more significant with the increase of depolarization potential, in a voltage-dependent manner. Allitridum also showed the inhibitory effect onKUrin a dose-dependent manner, with its IC50value of 149.6μmol/L. Allitridum caused a significant positive shift of the steady-state activation curve ofKUr, and then delayed the activation, while a markedly negative shift of the steady-state inactivation ofKUr, and so accelerated the inactivation. Furthermore, the drug markedly lengthened the time constants forKUrrecovery from inactivation, and decelerated the re-inactivation after inactivation. It decreased the channel open at many links, and reduced current density.Allitridum derived from Chinese herb, garlic bulb, potently blocksKUr, which might be the underlying cellular electrophysiological mechanism of its therapeutic effect on atrial arrhythmia.

allitridum; atrial cardiomyocytes; ultra rapid delayed rectifier potassium current; patch clamp technique

(No.30772886).

R285.5

A

10.3724/SP.J.1264.2013.00095

2013-03-18;

2013-04-03

國家自然科學(xué)基金（No. 30772886）

李 泱, Tel: 010-66936762, E-mail: liyangbsh@163.com