冠心病患者外周血內(nèi)皮祖細胞數(shù)量及生物學(xué)功能與肝細胞生長因子的關(guān)系

哈小琴*, 鄧芝云, 董菊子, 趙 勇, 彭俊華, 李曉云, 王 鯤

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冠心病患者外周血內(nèi)皮祖細胞數(shù)量及生物學(xué)功能與肝細胞生長因子的關(guān)系

哈小琴*, 鄧芝云, 董菊子, 趙 勇, 彭俊華, 李曉云, 王 鯤

（蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院檢驗醫(yī)學(xué)中心, 甘肅省干細胞與基因藥物重點實驗室, 蘭州 730050）

觀察冠心病患者外周血內(nèi)皮祖細胞（EPCs）數(shù)量及生物學(xué)功能的變化，進一步探討肝細胞生長因子（HGF）對其影響，為臨床應(yīng)用HGF提供理論依據(jù)。收集50例非冠心病患者（對照組）、50例冠心病患者（冠心病組；每例分為HGF干預(yù)組和非HGF干預(yù)組）外周血，應(yīng)用流式細胞儀和ELISA法分別檢測各組CD133+/CD34+細胞的數(shù)量和HGF水平；采用密度梯度離心法分離培養(yǎng)各組外周血中EPCs，通過MTT法、Transwell遷移試驗、黏附能力測定試驗及PI-AnnexinⅤ雙重染色法來分別檢測EPCs的增殖、遷移、黏附能力和凋亡水平。與對照組比較，冠心病組外周血中CD133+/CD34+細胞數(shù)量減少[（2.15±0.69）%（5.26±1.16）%，＜0.01]，血漿中HGF濃度升高[（6.80±1.22）（2.62±0.83）μg/L，＜0.01]，EPCs增殖、遷移、黏附等生物學(xué)功能減弱（＜0.05）；HGF干預(yù)組EPCs增殖、遷移、黏附等生物學(xué)功能顯著改善（＜0.05）。各組細胞凋亡水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05）。外周血中CD133+/CD34+細胞數(shù)量和血漿中HGF水平的變化可能成為冠心病患者新的危險評估因素。

冠心病; 內(nèi)皮祖細胞; 肝細胞生長因子

內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一種能定向分化為成熟血管內(nèi)皮細胞、具有很高的增殖潛能的前體細胞，能遷移、歸巢至血管新生部位，并在歸巢部位進一步增殖、分化為成熟的內(nèi)皮細胞（endothelial cells，ECs），形成新的血管[1]；在受損內(nèi)膜的再內(nèi)皮化和維持內(nèi)皮組織自身平衡中也起關(guān)鍵作用[2]。冠心病的本質(zhì)為血管病變，其與內(nèi)皮損傷和內(nèi)皮功能障礙關(guān)系密切；EPCs可參與內(nèi)皮修復(fù)，循環(huán)EPCs水平與內(nèi)皮功能密切相關(guān)，在冠心病的發(fā)生、發(fā)展中可能扮演重要角色[3]。肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）是一種具有多種功能的促血管生長因子，是間充質(zhì)和上皮/內(nèi)皮細胞間相互作用的重要信息分子，對內(nèi)皮系統(tǒng)的生物學(xué)功能起重要的調(diào)節(jié)作用[4]。本研究通過觀察冠心病患者外周血中EPCs在HGF干預(yù)前后各項生物學(xué)功能及凋亡的變化，來探討HGF對EPCs增殖、黏附、遷移能力及凋亡的影響，為HGF在冠心病防治中的應(yīng)用提供試驗基礎(chǔ)。

1 對象與方法

1.1 對象

研究對象均為蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院住院患者并知情同意。冠心病診斷參照世界衛(wèi)生組織1979年診斷標(biāo)準(zhǔn)。選取50例冠心病患者（冠心病組）和50例非冠心病患者（對照組）。兩組在年齡、性別、高血壓、糖尿病及高血脂等臨床資料方面條件齊同；排除有外傷、潰瘍、視網(wǎng)膜病、炎癥、腫瘤、近期外科手術(shù)、近3個月發(fā)生急性心肌梗死者。試驗分組：非冠心病患者為對照組，冠心病組患者依據(jù)是否應(yīng)用HGF干預(yù)分為HGF干預(yù)亞組和非HGF干預(yù)亞組。

1.2 試劑

M199培養(yǎng)基、Ficoll分離液（Gibco），胰蛋白酶（Amresco），Transwell小室（Costar），明膠和胎牛血清（杭州四季青）；小鼠抗人CD133單克隆抗體、小鼠抗人VEGFR2單克隆抗體、小鼠抗人CD34單克隆抗體（R&D）；免疫組化染色試劑盒及濃縮型DAB試劑盒（北京中杉金橋），二甲基亞砜（DMSO）及噻唑藍（二苯基四氮唑溴鹽，MTT；Sigma），小鼠抗人HGF單克隆抗體、重組人HGF蛋白純品（R&D）；PI-AnnexinⅤ凋亡檢測試劑盒（TaKaRa）。

1.3 全血CD133+/CD34+細胞數(shù)量檢測

將各組200μl EDTA抗凝全血與PE標(biāo)記的小鼠抗人CD133單克隆抗體及FITC標(biāo)記的小鼠抗人CD34單克隆抗體避光4℃孵育30min后，用FACSort流式細胞儀（Becton Dickinson，CellQuest軟件）分析檢測標(biāo)記細胞的數(shù)量。各樣本以其同型IgG作陰性對照。

1.4 血漿HGF水平檢測

將各組分離血漿與包被液以1∶3包被酶聯(lián)免疫反應(yīng)板，4℃過夜，20%BSA封閉，加入工作濃度的鼠抗人HGF單克隆抗體（1mg/L），37℃作用1h，隨后用PBST（PBS＋0.05%吐溫-20）洗滌，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記（HRP）的羊抗小鼠IgG（1∶1500）稀釋，37℃作用1h，PBST洗滌，OPD顯色，2mol/L硫酸中止反應(yīng)。同時用重組人HGF蛋白純品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，于酶標(biāo)儀上檢測490nm吸光度（490nm）值，并依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算HGF水平。

1.5 EPCs的分離培養(yǎng)

分別采集每名非冠心病患者空腹外周血15ml和冠心病患者空腹抗凝外周血15ml，采用密度梯度離心法分離單個核細胞，將單個核細胞接種于M199培養(yǎng)基（含20%胎牛血清，青霉素100kU/L，鏈霉素100kU/L）中，37℃、5%CO2培養(yǎng)4d，PBS再洗掉非貼壁細胞，換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至7d，PBS洗掉非貼壁細胞，貼壁細胞可進行后續(xù)試驗。HGF干預(yù)亞組在試驗時另加終濃度20μg/L的HGF蛋白純品（劑量依據(jù)預(yù)試驗選定）。

1.6 EPCs的鑒定

培養(yǎng)7d后的細胞制備爬片，采用免疫細胞化學(xué)法鑒定EPCs表面的特異性標(biāo)志：CD133，CD34和VEGFR2。即取出細胞爬片，PBS漂洗后10%甲醛固定細胞，滴加正常山羊血清工作液室溫20min；滴加一抗（小鼠抗人CD133，CD34和VEGFR2單克隆抗體），4℃過夜，PBS沖洗；滴加生物素化二抗工作液和HRP標(biāo)記鏈霉卵白素工作液室溫置30min后，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，熒光顯微鏡下觀察。

1.7 EPCs生物學(xué)功能的檢測

1.7.1 EPCs增殖能力檢測 將各組貼壁細胞培養(yǎng)7d后，用0.25%胰蛋白酶消化并計數(shù)，調(diào)整細胞懸液為3×107/L，將100μl接種于包被有0.1%明膠的96孔培養(yǎng)板中，同時設(shè)空白對照孔（僅加培養(yǎng)液），每組6個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)72h后每孔加入MTT（5g/L）20μl，培養(yǎng)4h后，吸棄上清液，再加入DMSO（150μl/孔），充分振蕩后，置酶標(biāo)儀測490nm值。

1.7.2 EPCs黏附能力檢測 各組貼壁細胞培養(yǎng)7d后，用0.25%胰蛋白酶消化收集各組貼壁細胞，懸浮在500μl完全培養(yǎng)液中吹打均勻，然后將同等數(shù)目的EPCs接種在包被有明膠的96孔培養(yǎng)板里，37℃、5%CO2培養(yǎng)30min后，洗去未貼壁細胞，計數(shù)貼壁細胞。

1.7.3 EPCs遷移能力檢測 各組貼壁細胞消化并計數(shù)，將3×103個細胞置入Transwell小室的上室，含有HGF的培養(yǎng)液注入下室，培養(yǎng)24h后，取出Transwell小室，PBS液淋洗，用消毒棉簽擦去微孔膜上層的未移動細胞，用甲醇固定，Giemsa染色，隨機選擇5個顯微鏡視野（×200），計數(shù)遷移到濾膜下面的細胞。

1.7.4 EPCs凋亡水平檢測 用不含血清的M199培養(yǎng)細胞，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于12和24h觀察3組細胞的存活狀態(tài)。并根據(jù)凋亡檢測試劑盒說明書進行染色檢測。于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果及攝片。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用兩獨立樣本比較的檢驗。＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 外周血中CD133+/CD34+細胞數(shù)

流式細胞儀檢測結(jié)果顯示（圖1，表1），與對照組比較，冠心病組外周血CD133+/CD34+細胞數(shù)量明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）。

2.2 外周血漿中HGF的表達水平

ELISA結(jié)果顯示（表1），與對照組比較，冠心病組外周血漿中HGF的表達水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）。

表1 冠心病組和對照組患者外周血中CD133+/CD34+細胞比例及HGF含量

CHD: coronary heart disease; HGF: hepatocyte growth factor. Compared with control group,**＜0.01

2.3 EPCs的鑒定

分離培養(yǎng)的單個核細胞3d后開始貼壁生長，隨著培養(yǎng)時間的延長，大部分細胞由小圓形逐漸伸展變成長梭形內(nèi)皮樣細胞，小部分細胞呈鵝卵石樣內(nèi)皮形態(tài)。小部分細胞成圓形，部分細胞形成集落，中心是圓形細胞，四周長梭形細胞呈放射樣排列（圖2A）。分別用小鼠抗人CD133，CD34和VEGFR2單克隆抗體檢測第7天貼壁細胞表面抗原的表達，結(jié)果均呈陽性反應(yīng)（圖2B，2C，2D）。即分離培養(yǎng)的貼壁細胞具有EPCs特征。

2.4 各組外周血EPCs生物學(xué)功能的檢測

冠心病組患者外周血EPCs的增殖、黏附和遷移能力較對照組患者均明顯下降（＜0.05）；在冠心病組中，HGF干預(yù)亞組較非HGF干預(yù)亞組EPCs的增殖、黏附和遷移各項生物學(xué)指標(biāo)明顯增高（＜0.05；表2，圖3）。

圖1 冠心病組和對照組患者外周血中CD133+/CD34+細胞流式細胞檢測

Figure1 Detection of CD133+/CD34+cells in peripheral blood of patients by flow cytometry A: control group; B: CHD group

圖2 免疫細胞化學(xué)法對培養(yǎng)第7天EPCs進行表面抗原鑒定

Figure 2 Identification of surface antigen in EPCs cultured at 7 days by immunocytochemistry (DAB staining×10) EPCs: endothelial progenitor cells; A: EPCs ; B: CD133 positive EPCs; C: CD34 positive EPCs; D: VEGFR2 positive EPCs

2.5 HGF對外周血EPCs凋亡的影響

12和24h凋亡細胞的比例在冠心病組與對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05），冠心病非HGF干預(yù)亞組和冠心病HGF干預(yù)亞組間在12和24h的凋亡細胞比例仍無明顯差異（＞0.05；表3，圖4）。

3 討 論

近年的研究表明，內(nèi)皮損傷和功能障礙與冠心病密切相關(guān)。內(nèi)皮功能障礙的本質(zhì)是內(nèi)皮損傷和修復(fù)之間動態(tài)平衡的破壞[5]。EPCs在血管新生和維持內(nèi)皮功能完整中具有重要作用。血管EPCs不僅參與胚胎期的血管發(fā)育，也存在于成年機體的骨髓及外周血，參與成人機體血管新生和內(nèi)皮損傷后的修復(fù)，新生血管中25%的內(nèi)皮細胞是由EPCs分化而來[6,7]。近年的研究表明，骨髓、外周血及臍血中的CD34+細胞或VEGFR-2+細胞或CD133+細胞離體培養(yǎng)2周后均能分化為內(nèi)皮細胞，從而證實成年個體中也存在EPCs[8]；EPCs在血管新生和維持內(nèi)皮功能完整中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)冠心病患者循環(huán)EPCs的數(shù)量及其遷移活性明顯受損，并與冠狀動脈粥樣硬化程度呈正相關(guān)[9,10]。因此，如何促進EPCs遷移至病變血管段黏附，并促進其增殖與生長，是解決這一問題的有效途徑。

表2 各組EPCs增殖、黏附和遷移能力的變化

CHD: coronary heart disease; HGF: hepatocyte growth factor. Compared with control group,*＜0.05; compared with CHD without HGF subgroup,#＜0.05

表3 HGF對外周血EPCs凋亡的影響

CHD: coronary heart disease; HGF: hepatocyte growth factor

圖3 各組EPCs遷移能力的變化

Figure 3 Changes in migration capability of EPCs in 3 groups (Giemsa staining×20) EPCs: endothelial progenitor cells; A: control group; B: CHD without HGF subgroup; C: CHD with HGF subgroup. Compared with control group, the migration capability of EPCs in patients with CHD group was significantly decreased. HGF treatment can improve the migration capability of EPCs in CHD group

圖4 PI-AnnexinⅤ雙重染色觀察EPCs凋亡

Figure 4 EPCs apoptosis by PI-AnnexinⅤ double staining (×10) EPCs: endothelial progenitor cells; A, B: EPCs apoptosis at 12 and 24h in control group; C,D: EPCs apoptosis at 12 and 24h in CHD with HGF; E,F: EPCs apoptosis at 12 and 24h in CHD without HGF

本研究用流式細胞技術(shù)檢測冠心病患者外周血中的CD133+/CD34+細胞及體外培養(yǎng)EPCs，發(fā)現(xiàn)冠心病患者外周血中CD133+/CD34+細胞數(shù)目減少，與此同時冠心病患者外周血分離的EPCs生物學(xué)功能均顯著下降，進一步證實上述發(fā)現(xiàn)。

血管EPCs表達CD133、CD34、Tie22、vW因子等多種分子，同時也表達HGF的受體c-Met[11]。HGF是一種具有多種功能的促血管生長因子，通過與其特異性膜受體c-Met結(jié)合而在發(fā)育、組織器官再生、傷口愈合和血管發(fā)生中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[12,13]。HGF與其受體結(jié)合，引起一系列信號分子的激活，最終可導(dǎo)致內(nèi)皮細胞的生長和遷移。本研究檢測發(fā)現(xiàn)，冠心病患者血漿中HGF表達水平是上升的，HGF能夠明顯改善體外培養(yǎng)的冠心病患者EPCs的各項生物學(xué)功能；并且發(fā)現(xiàn)HGF對于EPCs增殖能力的改善明顯強于對黏附及遷移能力的改善，提示HGF對EPCs功能影響主要在于提高其量而非質(zhì)。同時表明冠心病患者血漿中的HGF是代償性增加的。從細胞凋亡的角度出發(fā)，HGF對冠心病患者EPCs無保護作用。

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（編輯: 周宇紅）

Relationship of number and biological functions of endothelial progenitor cells in peripheral blood of coronary heart disease patients with hepatocyte growth factor

HA Xiao-Qin*, DENG Zhi-Yun, DONG Ju-Zi, ZHAO Yong, PENG Jun-Hua, LI Xiao-Yun, WANG Kun

(Center of Clinical Laboratory, Key Laboratory of Stem Cells and Gene Medicine of Gansu Province, Lanzhou General Hospital, Lanzhou Military Command, Lanzhou 730050, China)

To investigate the changes of the number and biological functions of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood of patients with coronary heart disease (CHD) and determine the effect of hepatocyte growth factor (HGF) on the cell number and function, so as to provide theoretical basis for further clinical application of HGF.A random controlled trial was carried out on 50 CHD patients and 50 control subjects matched in age, sex, hypertension, diabetes and hyperlipidemia. The number of EPCs (CD133+/CD34+) and the level of HGF in peripheral blood of each group were measured respectively by flow cytometry and ELISA. The proliferation, migration, apoptosis and adhering ability of EPCs were detected by MTT assay, Transwell migration experiment, PI-AnnexinⅤ double staining and adhering experiment, respectively.Compared with control group, the number of CD133+/CD34+cells in peripheral blood of CHD patients was significantly lower[(2.15±0.69)%(5.26±1.16)%,＜0.01]; the plasma level of HGF was higher [(6.80±1.22)(2.62±0.83)μg/L,＜0.01]; and the ability of proliferating, migrating and adhering of EPCs was reduced(＜0.05). HGF significantly improved the biological function of EPCs isolated from patients with CHD(＜0.05), but had no effect on the apoptosis of EPCs(＞0.05).The number of CD133+/CD34+cells in peripheral blood and plasma level of HGF might be used as new risk assessment factor for CHD patients.

coronary heart disease; endothelial progenitor cells; hepatocyte growth factor

(81060015, 81273568).

R541.4

A

10.3724/SP.J.1264.2013.00204

2013?06?19;

2013?08?06

國家自然科學(xué)基金（81060015, 81273568）

哈小琴, E-mail: 842917389@qq.com