聚酰胺胺超支化聚合物的細(xì)胞毒性及抗菌性能

饒發(fā)明, 林 希, 黃維哲 ，吳江渝*

(1. 武鋼集團(tuán)礦業(yè)有限公司烏龍泉礦，湖北 武漢 430213;2. 武漢工程大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430074)

0 引 言

抑制微生物生長(zhǎng)和繁殖的工藝是水處理中非常重要的一環(huán)，直接決定了水質(zhì)及其使用范圍.傳統(tǒng)的水處理抗菌試劑主要是含氯氧化劑，如液氯、二氧化氯和氯胺等，這些抗菌試劑在殺菌的同時(shí)會(huì)與水中的微量有機(jī)物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，生成三氯甲烷等具有高毒副作用的副產(chǎn)物，嚴(yán)重影響人體健康.因此，各種水處理抗菌劑被廣泛研究用以替代含氯試劑，如納米二氧化鈦材料[1]、納米金屬材料[2]、有機(jī)無(wú)機(jī)雜化材料[3-4]以及一些生物活性分子[5-6]等.超支化聚合物[7-8]是一類(lèi)具有高度支化分子結(jié)構(gòu)以及大量末端官能團(tuán)的高分子化合物.這類(lèi)化合物合成方法簡(jiǎn)便，制備成本低廉，加上其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)特性，是理想的水處理試劑基體，并已被用于絮凝脫色[9]及重金屬離子移除[10]的研究.

聚酰胺胺型超支化化合物[11-12]是超支化聚合物的重要類(lèi)別，其末端具有大量的伯胺基團(tuán)，可以通過(guò)與細(xì)菌的細(xì)胞膜相互作用而抑制其生長(zhǎng)繁殖，因此超支化聚酰胺胺化合物可用于抗菌試劑開(kāi)發(fā).本研究選用乙二胺和丙烯酸甲酯為原料，首先反應(yīng)生成小分子預(yù)聚物，繼而通過(guò)逐步升溫使其聚合成具有高分子量和高度支化結(jié)構(gòu)的超支化聚酰胺胺化合物.以Hela細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象對(duì)合成的超支化化合物進(jìn)行了細(xì)胞毒性的測(cè)試.以大腸桿菌(革蘭氏陰性菌)和金黃葡萄球菌(革蘭氏陽(yáng)性菌)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象測(cè)試了超支化聚酰胺胺化合物的抗菌性能，以期為開(kāi)發(fā)新型水處理抗菌試劑提供相關(guān)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及理論依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料

乙二胺(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，分析純，用前重蒸)，丙烯酸甲酯(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，分析純，用前重蒸)，Hela細(xì)胞由武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院提供，大腸桿菌(Escherichiacoli)和金黃葡萄球菌(Staphylococcusaureus)均由華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供.

1.2 超支化聚酰胺胺的合成

10 g乙二胺溶于5 mL甲醇，緩慢滴加14.3 g丙烯酸甲酯，常溫?cái)嚢璺磻?yīng)，得到小分子預(yù)聚物.所得預(yù)聚物通過(guò)60，80，100，120，140 ℃逐步升溫，升溫過(guò)程采用油泵真空處理，得到黃色透明狀固體，用乙醚多次沉降后透析，經(jīng)冷凍干燥得到超支化聚酰胺胺化合物.合成路線如圖1所示.所得超支化聚合物經(jīng)核磁共振氫譜及紅外光譜表征[13].

圖1 超支化聚酰胺胺的合成Fig.1 The synthesis of hyperbranched PAMAM

1.3 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

選用Hela細(xì)胞，接種到24孔板中，細(xì)胞密度為25 000 個(gè)/孔，在DMEN培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h.以培養(yǎng)基為溶劑，在24孔板中引入超支化聚酰胺胺化合物，最高質(zhì)量濃度為80 mg/mL，最低質(zhì)量濃度為0.002 44 mg/mL，并作空白對(duì)照.24 h后于24孔板中加入MTT試劑(終質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL)，反應(yīng)4 h后，移除多余溶液，加入DMSO，染色后細(xì)胞呈紫色，利用酶標(biāo)儀測(cè)量吸光度，在590 nm處測(cè)得細(xì)胞溶液的吸收值，并計(jì)算細(xì)胞成活率.

1.4 抑菌實(shí)驗(yàn)

1.4.1 超支化聚酰胺胺對(duì)大腸桿菌的抑菌實(shí)驗(yàn) 選用大腸桿菌接種到96孔板LB培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，同時(shí)引入超支化聚酰胺胺化合物，最高質(zhì)量濃度為25 mg/mL，最低質(zhì)量濃度為0.012 2 mg/mL，并作空白對(duì)照.將含有超支化聚酰胺胺的大腸桿菌培養(yǎng)液及空白對(duì)照置于搖床培養(yǎng)，每隔半小時(shí)對(duì)菌種生長(zhǎng)情況進(jìn)行測(cè)量，并記錄結(jié)果.

1.4.2 超支化聚酰胺胺對(duì)金黃葡萄球菌的抑菌實(shí)驗(yàn) 選用金黃葡萄球菌接種到96孔板LB培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，同時(shí)引入超支化聚酰胺胺化合物，最高質(zhì)量濃度為25 mg/mL，最低質(zhì)量濃度為0.012 2 mg/mL，并作空白對(duì)照.將含有超支化聚酰胺胺的大腸桿菌培養(yǎng)液及空白對(duì)照置于搖床培養(yǎng)，每隔半小時(shí)對(duì)菌種生長(zhǎng)情況進(jìn)行測(cè)量，并記錄結(jié)果.

2 結(jié)果與討論

2.1 超支化聚酰胺胺的細(xì)胞毒性

圖2是超支化聚酰胺胺化合物對(duì)Hela細(xì)胞的毒性測(cè)試結(jié)果：

圖2 超支化聚酰胺胺對(duì)Hela細(xì)胞的毒性測(cè)試 Fig.2 The test of cytotoxicity of hyperbranched PAMAM with Hela cells 注：lnC為化合物質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值，C的單位為mg/mL.

細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，在較低濃度時(shí)(lnC值在-4.5～-6之間)，超支化聚酰胺胺對(duì)Hela細(xì)胞的毒性較小，細(xì)胞成活率在80%以上，隨濃度升高，化合物溶液的細(xì)胞毒性逐漸增大，但直到質(zhì)量濃度為20 mg/mL時(shí)(lnC≈3)，細(xì)胞成活率仍保持在50%以上.繼續(xù)增加濃度導(dǎo)致超支化聚酰胺胺的細(xì)胞毒性上升，質(zhì)量濃度為80 mg/mL時(shí)，細(xì)胞成活率在30%左右.

超支化聚酰胺胺的細(xì)胞毒性來(lái)自于其表面大量的伯胺基團(tuán).細(xì)胞由細(xì)胞壁，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核組成，其中細(xì)胞壁含有大量的磷脂.超支化聚酰胺胺表面的伯胺基帶正電荷，易與帶負(fù)電荷的磷脂結(jié)合破壞細(xì)胞壁，從而導(dǎo)致細(xì)胞壁的破裂，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)流出，細(xì)胞因此凋亡.

2.2 超支化聚酰胺胺的抗菌性能

2.2.1 對(duì)大腸桿菌(革蘭氏陽(yáng)性菌)的抑制結(jié)果 選取質(zhì)量濃度為25、12.5、3.125 mg/mL和1.563 mg/mL超支化聚酰胺胺化合物的抑菌曲線作圖，如圖3所示.橫坐標(biāo)為細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)間，縱坐標(biāo)為細(xì)菌溶液吸光度，用以說(shuō)明細(xì)菌的繁殖程度.空白對(duì)照，即不含超支化聚酰胺胺化合物的大腸桿菌生長(zhǎng)情況.

圖3 超支化聚酰胺胺對(duì)大腸桿菌的抗菌性能Fig.3 The antimicrobial activity of hyperbranched PAMAM with Escherichia coli

從圖3中可知，在沒(méi)有超支化聚酰胺胺存在時(shí)，大腸桿菌隨時(shí)間增加繁殖程度變化明顯，在約3 h之內(nèi)繁殖較快，之后則速度放緩，但仍保持一定的生長(zhǎng)趨勢(shì).在超支化聚合物濃度較低時(shí)(如1.563 mg/mL和3.125 mg/mL)，大腸桿菌在初期的生長(zhǎng)速度雖略有下降，但仍然很快；而在3 h之后，溶液的吸光值基本保持不變，表明大腸桿菌的繁殖與消亡達(dá)到平衡.由此可知超支化聚酰胺胺在低濃度時(shí)即有一定的抗菌性能.在濃度較高時(shí)(如12.5 mg/mL和25 mg/mL)，超支化聚酰胺胺則可以完全抑制大腸桿菌的生長(zhǎng).其抑菌效果略低于文獻(xiàn)報(bào)道[14].

2.2.2 對(duì)金黃葡萄球菌(革蘭氏陽(yáng)性菌)的抑制結(jié)果 選取質(zhì)量濃度為25、3.125、0.4 mg/mL和0.05 mg/mL超支化聚酰胺胺化合物的抑菌曲線作圖，如圖4所示.橫坐標(biāo)為細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)間，縱坐標(biāo)為細(xì)菌溶液吸光度，用以說(shuō)明細(xì)菌的繁殖程度.空白對(duì)照，即不含超支化聚酰胺胺化合物的金黃葡萄球菌生長(zhǎng)情況.

圖4 超支化聚酰胺胺對(duì)金黃葡萄球菌的抗菌性能Fig.4 The antimicrobial activity of hyperbranched PAMAM with Staphylococcus aureus

從圖4中可知，在沒(méi)有超支化聚酰胺胺存在時(shí)，金黃葡萄球菌隨時(shí)間增加繁殖程度變化明顯，在測(cè)試時(shí)間范圍內(nèi)基本保持一定的生長(zhǎng)速度.在所測(cè)試的較大濃度范圍內(nèi)(0.05～25 mg/mL)，超支化聚酰胺胺都可以顯示出良好的抗菌性能，完全抑制金黃葡萄球菌的生長(zhǎng).該化合物抑菌效果優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道[14].

從抑菌曲線可知超支化聚酰胺胺對(duì)大腸桿菌，金黃葡萄球菌的生長(zhǎng)都有一定的抑制作用，但抑制效果有所不同.其中超支化化合物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌金黃葡萄球菌的抗菌效果要明顯好于革蘭氏陰性菌大腸桿菌.這與兩種細(xì)菌的不同結(jié)構(gòu)有關(guān).革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的差別主要來(lái)自于它們的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不同.革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁壁厚約為20～80 nm，主要成分是肽聚糖和磷壁酸，二者含量占整個(gè)細(xì)胞壁質(zhì)量的90%.革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁較薄，磷壁酸只占大約5%，但是其細(xì)胞壁組分比較復(fù)雜，有一層陽(yáng)性菌所不具備的外膜結(jié)構(gòu)，對(duì)于外源分子形成了一層附加的屏障，從而阻止其與細(xì)菌進(jìn)行作用.超支化聚酰胺胺末端帶有大量帶正電荷的伯胺基團(tuán)，屬于陽(yáng)離子抗菌劑.一般而言，陽(yáng)離子抗菌劑通過(guò)破壞肽聚糖結(jié)構(gòu)從而達(dá)到殺菌的目的.因此，超支化聚酰胺胺化合物對(duì)大腸桿菌的抑制效果不如金黃葡萄球菌.

通過(guò)合成得到的超支化聚酰胺胺對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌金黃葡萄球菌及革蘭氏陰性菌大腸桿菌均有一定的抑制效果，特別是對(duì)于金黃葡萄球菌有較佳的抗菌性能，可以以此為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)具有超支化結(jié)構(gòu)的水處理抗菌劑.

3 結(jié) 語(yǔ)

a. 以丙烯酸甲酯和乙二胺為原料，通過(guò)逐步升溫法制備了超支化聚酰胺胺化合物，其末端帶有大量伯胺基團(tuán).

b. 對(duì)合成的超支化聚酰胺胺進(jìn)行了細(xì)胞毒性測(cè)試，結(jié)果表明其細(xì)胞毒性隨質(zhì)量濃度增加而增大，在20 mg/mL以下時(shí)細(xì)胞毒性較小，細(xì)胞存活率在50%以上.

c. 以革蘭氏陽(yáng)性菌金黃葡萄球菌及革蘭氏陰性菌大腸桿菌為實(shí)驗(yàn)對(duì)象測(cè)試了超支化聚酰胺胺的抗菌性能，結(jié)果表明超支化聚酰胺胺對(duì)大腸桿菌和金黃葡萄球菌均有一定的抑制效果，在12.5 mg/mL時(shí)可以完全抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)，而在0.05 mg/mL濃度下即可完全抑制金黃葡萄球菌的生長(zhǎng).超支化聚酰胺胺化合物在水處理抗菌劑方面具有廣闊的應(yīng)用前景.

致 謝

本研究得到國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)的資助，特表感謝！

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