主動(dòng)外排泵對(duì)銅綠假單胞菌攝入硅納米顆粒的影響研究

敖 翔，唐愛(ài)國(guó)，羅昔波，皮蘭敢，章 清

近年來(lái)，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)對(duì)人致病作用明顯增強(qiáng)，成為一系列嚴(yán)重化膿性感染尤其是支氣管擴(kuò)張、慢性支氣管炎、囊性肺纖維化等疾病繼發(fā)感染的重要致病菌[1-2]。隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌的耐藥性越來(lái)越嚴(yán)重且有明顯的上升趨勢(shì)，給臨床治療造成了極大困難[3]。目前為止，研究者們發(fā)現(xiàn)的PA耐藥原因有以下幾個(gè)方面：外膜的通透性降低，外排蛋白D2缺失[3]，藥物的主動(dòng)外排系統(tǒng)作用[4-9]，β-內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷鈍化酶的產(chǎn)生，靶位的改變以及細(xì)菌生物被膜的形成。本研究通過(guò)在PA菌液中加入硅納米顆粒并進(jìn)行培養(yǎng)，觀察硅納米顆粒是否能進(jìn)入并存留在PA內(nèi)，旨在探討PA主動(dòng)外排泵對(duì)PA攝入硅納米顆粒的影響，為將其作為藥物載體提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 收集中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院2007年1—6月檢測(cè)的PA臨床菌株24株，分別編號(hào)為S1～S24，均采用Micro Scan Walk Away 96微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。PA01為PA的野生菌株，作為MexA基因的陽(yáng)性對(duì)照，來(lái)自西北大學(xué)中科院分子微生物實(shí)驗(yàn)室；ATCC27853為PA的標(biāo)準(zhǔn)菌株，購(gòu)自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心，符合美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。硅納米顆粒為自制，制作方法參照文獻(xiàn)[10]。

1.2 主要試劑及儀器 細(xì)菌總RNA抽提試劑Trizol購(gòu)自Invitrogen Life Technologies公司；TaKaRa dNTPs TaqTM及緩沖系統(tǒng)、6xloading buffer及DNA marker(O′GeneRuler 100bp Ladder Plus)均為晶美生物有限公司產(chǎn)品；引物序列參照文獻(xiàn)[11]，由上海生工生物公司合成，Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司。QIAGEN One Step RT-PCR Kit購(gòu)自QIAGEN公司。主要儀器有超凈工作臺(tái)(蘇州凈化)，Eppendorf臺(tái)式低溫微量離心機(jī)，凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad)，瓊脂糖水平電泳儀(Bio-Rad)，二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(Forma 公司)。

1.3 方法 PA菌株根據(jù)《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第3版按常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng)，將24株P(guān)A臨床菌株用Trizol試劑抽提總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)一步法擴(kuò)增引物，進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀下成像[9]。將篩選出的6株P(guān)A臨床菌株及野生菌株P(guān)A01培養(yǎng)到對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，分別以終濃度為30 μg/ml(高濃度組)和終濃度為6 μg/ml(低濃度組)的硅納米顆粒加入到菌液中，培養(yǎng)2、4、8、12、24 h時(shí)取樣并在電子顯微鏡下觀察硅納米顆粒攝入情況。

2 結(jié)果

2.1 電泳結(jié)果 電泳結(jié)果顯示，24株P(guān)A臨床菌株菌液中均有不同程度的外排泵基因表達(dá)(見(jiàn)圖1～4)，其中6株(S4、S9、S12、S13、S20、S24)菌液中同時(shí)包含兩種以上主動(dòng)外排泵基因。

2.2 納米顆粒攝入情況 電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示，硅納米顆粒在菌液內(nèi)的分布無(wú)特異性，均能通過(guò)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)，分布在細(xì)胞器和胞質(zhì)中；僅表達(dá)1種外排泵基因(MexA)的PA01與同時(shí)表達(dá)4種外排泵基因(MexA、MexC、MexX、MexE)的S24攝入的硅納米顆粒情況相似(見(jiàn)圖5)；PA01菌液培養(yǎng)2 h時(shí)可以發(fā)現(xiàn)硅納米顆粒攝入，以12、24 h時(shí)硅納米顆粒攝入最多，且攝入情況相似(見(jiàn)圖6)；高濃度組S24培養(yǎng)24 h時(shí)硅納米顆粒攝入量是低濃度組的2倍(見(jiàn)圖7)。

3 討論

目前，盡管主動(dòng)外排泵的作用在PA耐藥機(jī)制研究中越來(lái)越受到重視，但攻克主動(dòng)外排泵的外排作用這一難題仍未得到解決[12-13]。抗菌藥物需要一定的濃度和作用時(shí)間才能有效殺滅細(xì)菌，而主動(dòng)外排泵的存在極大地影響了抗菌藥物的療效。為特異地封閉細(xì)菌主動(dòng)外排泵，人們假想了幾種可能途徑：在外膜通道中增加阻礙物，競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)膜泵，改變膜的組裝，瓦解主動(dòng)外排泵的能量組分等[12]。1990年，革蘭陰性菌泵抑制劑被研究出來(lái)后，泵抑制劑在PA中的研究也越來(lái)越多。但由于泵抑制劑的自身局限性，目前還沒(méi)有一種泵抑制劑能夠用于臨床治療，外排泵抑制劑的研發(fā)工作任重而道遠(yuǎn)。納米顆粒因自身獨(dú)特的優(yōu)越性而被廣泛用作藥物載體，納米藥物載體具有增加藥物在病變部位的作用時(shí)間、減少機(jī)體攝取藥物總量、增加巨噬細(xì)胞對(duì)藥物的攝取量等優(yōu)點(diǎn)，并且解決了藥物不能通過(guò)血-腦脊液屏障、血-睪屏障等生理性屏障這個(gè)一直讓研究者們頭疼的問(wèn)題。

圖1 外排泵基因MexA的表達(dá)情況圖2 外排泵基因MexC的表達(dá)情況

Figure1 Gene expression of MexA Efflux pumpFigure2 Gene expression of MexC Efflux pump

圖3 外排泵基因MexX的表達(dá)情況圖4 外排泵基因MexE的表達(dá)情況

Figure3 Gene expression of MexX Efflux pumpFigure4 Gene expression of MexE Efflux pump

注：A為PA01，B為S24

圖5 高濃度組菌株培養(yǎng)12 h時(shí)硅納米顆粒攝入情況(×100 000)

Figure5 Result of the silica nanoparticles uptake by Pseudomonas aeruginosa in the high concentration group after 12 hours

注：A為低濃度組，B為高濃度組

圖7 不同濃度組S24培養(yǎng)24 h時(shí)硅納米顆粒攝入情況(×100 000)

Figure7 Result of the silica nanoparticles uptake by PA S24 in different concentration group after 24 hours

注：A～E培養(yǎng)時(shí)間分別為2、4、8、12、24 h，加入硅納米顆粒濃度為30 μg/ml；F為空白對(duì)照，培養(yǎng)時(shí)間為12 h，加入硅納米顆粒濃度為0

圖6 PA01攝入硅納米顆粒情況(×100 000)

Figure6 Result of the silica nanoparticles uptake by PA01

納米顆粒可能由于其自身體積小及本身所具有的特殊效應(yīng)能進(jìn)入到含主動(dòng)外排泵的PA體內(nèi)，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)藥物發(fā)揮作用的時(shí)間設(shè)定了2、4、8、12、24 h 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察硅納米顆粒進(jìn)入PA體內(nèi)的情況，結(jié)果顯示：菌液中加入硅納米顆粒2 h后已經(jīng)能在電子顯微鏡下觀察到硅納米顆粒的攝入，而以12、24 h時(shí)攝入最多。表明硅納米顆粒不完全受主動(dòng)外排泵的影響，至少有一部分硅納米顆粒能進(jìn)入到細(xì)菌體內(nèi)并持續(xù)一段時(shí)間，這為硅納米顆粒作為藥物載體對(duì)抗主動(dòng)外排泵的外排作用，延長(zhǎng)抗菌藥物在細(xì)菌體內(nèi)的作用時(shí)間提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。對(duì)比僅表達(dá)1種外排泵基因MexA的PA01和同時(shí)表達(dá)4種外排泵基因(MexA、MexC、MexE、MexX)的臨床菌株S24硅納米顆粒攝入情況發(fā)現(xiàn)，兩者硅納米顆粒攝入量相似，提示主動(dòng)外排泵基因MexC、MexE、MexX的表達(dá)對(duì)菌株硅納米顆粒攝入無(wú)明顯抑制作用。由于本實(shí)驗(yàn)未選取不含任何主動(dòng)外排泵的PA菌株作為陰性對(duì)照，所以尚不能完全排除主動(dòng)外排泵對(duì)硅納米顆粒攝入的抑制作用，但含主動(dòng)外排泵的PA菌株能攝取相當(dāng)數(shù)量的硅納米顆粒，即使有少量被外出，也不影響其作為藥物載體的應(yīng)用。

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