三磷酸腺苷結合盒轉(zhuǎn)運體G2與CD24在賁門腺癌中的表達及臨床意義研究

劉月平，王小玲，張 勐，張玲玲，楊會釵，陳硯凝

賁門癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。河北省是賁門癌的高發(fā)區(qū)，其病死率已居國內(nèi)第2位，然而其病因至今仍不十分清楚。近年來研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)病的生物學基礎與腫瘤干細胞(tumor stem cell，TSC)密切相關，與諸多惡性腫瘤一樣更傾向于它是一種干細胞疾病。

TSC是腫瘤中有自我更新能力且在分化增殖過程中逐漸具有異質(zhì)性的腫瘤細胞。腫瘤被認為是一種干細胞疾病[1]，賁門腺癌的增殖分化取決于存在癌組織中的少量TSC。三磷酸腺苷結合盒轉(zhuǎn)運體G2(ABCG2)是ABC家族的G2成員[2]，是公認的TSC標志物，它參與調(diào)節(jié)干細胞的分化及腫瘤的多藥耐藥機制[3]，它的高表達對患者的化療及預后有著不良影響。近年來越來越多的學者研究發(fā)現(xiàn)，ABCG2在許多惡性上皮性腫瘤中廣泛表達，如食管癌、賁門癌、結腸癌、乳腺癌及卵巢癌等，而在許多良性腫瘤中不表達或微量表達，這些都提示了ABCG2有可能參與腫瘤的惡性過程。CD24屬糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白，是P-選擇素配體的黏附分子，它由27個氨基酸組成,通過糖基磷脂酰肌醇黏附在細胞膜上[4]，參與正常組織結構的成熟、發(fā)育。Smith等[5]研究發(fā)現(xiàn)CD24在上皮和間質(zhì)來源的腫瘤增殖中起關鍵的作用，近年來研究證實CD24在卵巢癌、乳腺癌、非小細胞肺癌及胰腺癌干細胞中高表達，特別是在惡性消化道上皮腫瘤中表達率高，如食管癌、胃癌、大腸癌等，因此CD24極有可能是TSC標志物之一。本研究旨在探討ABCG2和CD24在賁門腺癌中的表達情況及其是否與賁門腺癌的惡性過程有關，為賁門腺癌的早期診斷和預后判定提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料選取河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院病理科2010年1—10月賁門腺癌手術切除標本的存檔蠟塊共155例，其中賁門腺癌組織140例，癌旁組織15例，均經(jīng)病理學檢查證實。140例患者中男120例，女20例；年齡40～80歲，中位年齡62歲；低分化56 例，中高分化84例；有淋巴結轉(zhuǎn)移者77例，無淋巴結轉(zhuǎn)移者63例；浸潤深度：侵及固有層(T0)1例，固有層及黏膜下層(T1)14例，肌層(T2)25例，漿膜(T3)44例，周圍軟組織(T4)56例；臨床分期〔TNM分期標準參照2012年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)診療規(guī)范〕：Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期分別為26例、65例、44例、5例；Lauren分型[6]：腸型119例，彌漫型21例；所有患者術前未進行任何治療且術后病理證實為腺癌。

1.2主要試劑ABCG2鼠抗人多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，鼠抗人CD24多克隆抗體購自上海邁新生物技術開發(fā)有限公司，DAB顯色試劑盒購自北京中杉生物技術有限公司，免疫組化Maxvision2/HRP檢測試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司。每次染色均同步設陰性和陽性對照。ABCG2陽性對照為胎盤組織，CD24陽性對照為扁桃體。

1.3方法采用免疫組化SP法測定ABCG2 和CD24在賁門腺癌中的表達情況。10%甲醛溶液固定石蠟包埋組織，連續(xù)4 μm 厚切片，常規(guī)脫蠟至水，進行SP 染色，分別用1.5%正常兔血清和0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)取代第一抗體作為替代對照和空白對照。

1.4陽性結果的判斷ABCG2 與CD24蛋白均定位于細胞膜及細胞質(zhì)中，陽性表現(xiàn)為瘤細胞胞膜及胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)清晰可見的、定位準確的淡黃色至棕黃色顆粒。高倍鏡下隨機選取10個視野進行觀察，染色強度0分為無色，1分為淺黃色，2分為棕黃色顆粒，3分為棕褐色顆粒。陽性細胞所占百分比，0分為陰性，1分為陽性細胞<10%，2分為11%～50%，3分為51%～75%，4分為>75%。將染色強度得分與陽性細胞百分比得分相乘，乘積>3分為免疫反應陽性。

1.5統(tǒng)計學方法所有數(shù)據(jù)應用SPSS 13.0軟件包進行處理；蛋白表達與臨床病理指標之間的關系分析采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1ABCG2的免疫組化結果

2.1.1ABCG2在癌組織和癌旁組織的表達情況賁門腺癌組織中ABCG2的陽性表達率為54.3%(76/140，見圖1)，癌旁組織中的陽性表達率為13.3%(2/15)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=9.089，P<0.05)。

2.1.2ABCG2表達與臨床病理特征間的關系ABCG2 的陽性表達率與賁門腺癌的分化程度、Lauren分型有相關性(P<0.01)，與患者的年齡、性別、浸潤深度、淋巴結轉(zhuǎn)移及臨床分期均無相關性(P>0.05，見表1)。

2.2CD24的免疫組化結果

2.2.1CD24在癌組織和癌旁組織的表達情況賁門腺癌組織中CD24的陽性表達率為45.0%(63/140，見圖2)，癌旁組織中的陽性表達率為6.7%(1/15)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=8.213，P<0.05)。

圖1　ABCG2在賁門腺癌中的陽性表達(SP 400×)

圖2　 CD24在賁門腺癌中的陽性表達(SP 400×)

2.2.2CD24表達與臨床病理特征間的關系CD24的陽性表達率與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結轉(zhuǎn)移、臨床分期及Lauren分型有相關性(P<0.05)，但與患者的年齡、性別均無相關性(P>0.05，見表1)。

表1　ABCG2和CD24表達與賁門腺癌臨床病理特征間的關系

3　討論

20世紀80年代至今，世界上許多地區(qū)，如亞洲、歐洲、北美等出現(xiàn)了胃癌發(fā)病率下降的趨勢，但令人費解的是食管癌、賁門癌的發(fā)病率卻有所上升，歐美國家過去以鱗狀細胞癌為主，如今逐漸演變?yōu)橄侔[癌對等的趨勢[7]。在我國食管胃交界腫瘤中，賁門腺癌居然占到了80%以上，且賁門腺癌具有惡性程度高、外侵率高、淋巴結轉(zhuǎn)移率高的特點[8]，已經(jīng)嚴重危害到了人們的生存健康。

本研究結果表明，賁門腺癌組織中ABCG2、CD24的陽性表達率均高于癌旁組織，說明兩種分子在賁門腺癌中具有一定的特異性，有可能參與癌的發(fā)生發(fā)展，并且從正常黏膜發(fā)展到癌，兩者的表達是一個上調(diào)的過程。ABCG2和CD24與賁門腺癌的病理組織學分級密切相關，腫瘤分化差者其TSC數(shù)量多，因此二者陽性表達率也上調(diào)，這也說明了這兩種標志物與干細胞的存在密不可分，而分化程度越低的癌組織其惡性程度也越高。近年來越來越多的學者研究發(fā)現(xiàn)ABCG2參與癌組織的多藥耐藥機制[2，9]，這種大量表達于癌組織細胞膜上的大分子蛋白發(fā)揮著泵的作用，它可有效地將已進入細胞內(nèi)的化療藥物泵出細胞外進而弱化化療效果，降低患者生存率，因此，即使癌組織分化程度較好，淋巴結無轉(zhuǎn)移，此種分子在癌組織中的陽性表達也應引起人們高度警惕。與ABCG2相比CD24更富于侵襲性，由本研究結果可知，CD24不僅隨腫瘤分化程度的降低、病理組織學分級的升高表達上調(diào)，更重要的是其還與賁門腺癌的浸潤深度、淋巴結轉(zhuǎn)移情況及TNM分期存在相關性，侵及漿膜或周圍軟組織(T3/T4)者CD24的陽性表達率較侵及黏膜層或固有肌層(T0/T2)者高，表明CD24與賁門腺癌的侵襲性呈正相關，是腫瘤惡化的證據(jù)；有淋巴結轉(zhuǎn)移者CD24的陽性表達率高于無淋巴結轉(zhuǎn)移者，表明CD24上調(diào)與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關。

探究賁門腺癌的形態(tài)學分化與某種分子是否具有關聯(lián)性可以更好地使研究方向具體化，為進一步的分子生物學研究做好鋪墊。探究這兩種標志物與腫瘤形態(tài)學的關聯(lián)時我們采用了Lauren分型，腸型一般具有較好的腺管分化，其分化以中高分化為主，也包括一部分低分化形態(tài)，但其特征有別于彌漫型，表現(xiàn)為腺管結構不清但瘤細胞呈巢團狀、索狀分布，而不是彌漫型的散在而廣泛的浸潤。在亞洲腸型胃癌患者較彌漫型居多，而彌漫型卻較少受地理位置的影響，但更易發(fā)生淋巴結轉(zhuǎn)移，因此預后差。

本研究結果還發(fā)現(xiàn)，在Lauren分型中彌漫型賁門腺癌患者癌組織中ABCG2、CD24的陽性表達率均高于腸型的陽性表達率，出現(xiàn)這種結果有兩種可能性：(1)存在某種分子機制調(diào)控腺癌向腸型、彌漫型分化，這種機制所帶來的結果是彌漫型ABCG2、CD24表達高于腸型；(2)彌漫型腺癌幾乎是低分化的，而腸型腺癌包括中高分化腺癌和部分低分化腺癌，二者在彌漫型中的表達高于在腸型中的表達，其可能原因是腸型低分化腺癌所占比例較低。因此盡管腸型、彌漫型有差異，但并不能證明在形態(tài)學分化上具有表達的差異性。

TSC理論的提出以及近些年來人們對TSC表面標志物的研究對諸如賁門癌等早期癥狀不明顯的惡性腫瘤提供了早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療的可能性，而對TSC表面特異性標志物的研究又提供了針對其特異抗原提供有效化療藥物的機會。本研究對TSC標志物ABCG2和CD24在賁門腺癌中的表達與臨床病理特征的關系進行了分析，以期為賁門腺癌的診療提供理論依據(jù)。相信隨著對TSC的研究，ABCG2和CD24作為TSC標志物將被越來越多的人所接受。

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3Doyle LA,Yang W,Abruzzo LV,et al.A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells[J].Proc Natl Sci USA,1998,95 (26):15665-15670.

4Allen JD,Schinkel AH.Multidrug resistance and pharmacological protection mediated by the breast cancer resistance protein (BCRP /ABCG2)[J].Mol Cancer Ther,2002,1(6):427-434.

5Smith SC,Oxford G,Wu Z,et al.The metastasis-associated gene CD24is regulated by Ral GTPase and is a mediator of cell proliferation and survival in human cancer[J].Cancer Res,2006,66(4):1917-1922.

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