胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞移植對(duì)大鼠脊髓損傷后神經(jīng)元特異性烯醇化酶和皮質(zhì)體感誘發(fā)電位的影響研究

孔令勝，靳 峰，郭 強(qiáng)，張 浩，胡亞偉

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)對(duì)機(jī)體造成災(zāi)難性的后果，表現(xiàn)為損傷節(jié)段平面以下感覺、運(yùn)動(dòng)功能完全喪失和大小便失禁。由于缺乏有效的治療方法，世界各國均把SCI的臨床治療作為一項(xiàng)難題及科研重點(diǎn)。神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)具有自我增殖能力和多向分化潛能，在神經(jīng)損傷修復(fù)方面有著良好的應(yīng)用前景[1-3]，NSCs移植已成為治療SCI新的研究熱點(diǎn)[4-6]，但對(duì)移植后神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)和皮質(zhì)體感誘發(fā)電位(CSEP)的變化研究少。本研究旨在動(dòng)態(tài)觀察NSCs移植對(duì)大鼠SCI后NSE和CSEP的影響，從而為NSCs移植治療SCI提供理論和物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 成年健康雄性清潔級(jí)SD大鼠40只，體質(zhì)量(250±20)g(徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)；5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu)抗體(Sigma)，基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM/F12，1∶1,Hyclone)，B27復(fù)合物(Gibco)，成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)，表皮樣生長因子(EGF，Invitrogen)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，多聚賴氨酸(Sigma)，巢蛋白(Nestin)抗體(Sigma)，NSE抗體(Sigma)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)液體(Boster)，二步法免疫組化試劑盒(Zymed)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純或化學(xué)純。自行研制的電控SCI自動(dòng)打擊裝置。NDI-200海神號(hào)神經(jīng)電檢診儀(上海海軍醫(yī)學(xué)研究所)。

1.2 方法

1.2.1 胚胎大鼠NSCs的分離培養(yǎng)和鑒定以及移植細(xì)胞的制備分別參見參考文獻(xiàn)[7]和[8]進(jìn)行。

1.2.2 大鼠SCI模型的制作及分組 SD大鼠40只按隨機(jī)數(shù)字表法分為Brdu+NSCs組、NSCs組、SCI組和假手術(shù)組(Sham組)，每組10只。Sham組僅做椎板切開術(shù)。SCI組：戊巴比妥鈉溶液(0.5 ml/100 g)腹腔麻醉后，將大鼠固定于立體定位儀上，以第13肋為標(biāo)志沿后正中線切開，咬除T13～L1椎板暴露脊髓，固定T12、L2椎體，以T13棘突相對(duì)應(yīng)的脊髓后正中血管為中心用電磁程控鐵棒下落打擊裝置損傷脊髓，打擊力量為10×2.5 g·cm。NSCs組：神經(jīng)干細(xì)胞植入損傷脊髓組。Brdu+NSCs組：Brdu標(biāo)記的神經(jīng)干細(xì)胞移植組。大鼠死亡及時(shí)復(fù)制模型補(bǔ)充。

1.2.3 脊髓內(nèi)NSCs移植 造模成功后即刻參考Miura等[9]方法行NSCs移植。大鼠麻醉后固定于立體定位儀上，原切口進(jìn)入，在平T13棘突處硬脊膜背側(cè)正中血管旁1 mm處輕輕挑開硬脊膜成一縱行小口，用漢密爾頓微量注射器，向頭側(cè)呈45°角進(jìn)針，深度1.5 mm，將細(xì)胞濃度為2×105/μl的NSCs懸液5 μl、0.9%氯化鈉溶液5 μl分別注入NSCs組、SCI組，10 min內(nèi)完成注射，保留5 min后退出。

1.2.4 CSEP檢查 參照人類CSEP檢測和記錄的方法，在室溫25 ℃的實(shí)驗(yàn)室中，大鼠腹腔麻醉，刺激電極置于內(nèi)踝脛后神經(jīng)上，陽極置遠(yuǎn)心端，小腿部皮下接地，記錄電極置于顱表相當(dāng)于人類的中央?yún)^(qū)(Cz)，參考電極置于前額區(qū)(FPz)，電極阻抗<5 kΩ，帶通范圍30～1 500 Hz，分析時(shí)間50 ms，刺激頻率3 Hz，刺激強(qiáng)度為引起趾的輕微收縮，疊加500 次，每次檢查至少重復(fù)2次，以求獲得較好的重復(fù)性[10]。CSEP檢測結(jié)束行組織病理學(xué)取材觀察。

1.2.5 蘇木素-伊紅(HE)染色、Brdu及NSE免疫組織化學(xué)染色 NSCs移植后第1、3、7、14、28 天取材，大鼠在深麻醉下，以0.4%多聚甲醛行心臟灌流固定，取損傷段脊髓，在30%蔗糖磷酸鹽緩沖液中沉底后，用冷凍切片機(jī)自SCI處做連續(xù)橫切片，片厚30 μm，切片收集于裝有0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液的細(xì)胞培養(yǎng)板的兩孔中，依次留片，每孔中留片15張。行常規(guī)HE染色及按二步法免疫組織化學(xué)試劑盒操作步驟進(jìn)行Brdu、NSE免疫化學(xué)染色。

1.2.6 圖像分析 采用LEICA QWin圖像處理與分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。在200倍鏡下計(jì)數(shù)脊髓沿中央導(dǎo)水管橫線以前NSE陽性細(xì)胞數(shù)；在400倍鏡下選擇不重疊的5個(gè)視野計(jì)算NSE陽性細(xì)胞灰度。

2 結(jié)果

2.1 皮質(zhì)體感誘發(fā)電位-P波(CSEP-P)檢測結(jié)果 Sham組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)CSEP-P潛伏期為17～18 ms，經(jīng)比較左右兩下肢測量的結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，統(tǒng)一選擇右下肢的測量結(jié)果。4組間各時(shí)間點(diǎn)CSEP-P潛伏期比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Sham組和SCI組各時(shí)間點(diǎn)間CSEP-P潛伏期比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而Brdu+NSCs組和NSCs組各時(shí)間點(diǎn)間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。其中SCI組、NSCs組和Brdu+NSCs組各時(shí)間點(diǎn)CSEP-P潛伏期與Sham組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；NSCs組和Brdu+NSCs組除第1天外余各時(shí)間點(diǎn)與SCI組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；Brdu+NSCs組與NSCs組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表1)。排除了Brdu對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

2.2 移植NSCs在脊髓內(nèi)的存活及遷移 Brdu陽性細(xì)胞呈時(shí)間依賴性變化趨勢(shì)[8]：Brdu陽性細(xì)胞在移植術(shù)后第7天可檢測到，為棕黃色核標(biāo)記的小圓形細(xì)胞，沿移植穿刺針道呈串珠狀排列，Brdu陽性細(xì)胞平均每高倍鏡視野陽性細(xì)胞數(shù)為(7.3±1.7)個(gè)；第14天移植細(xì)胞在臨近損傷區(qū)逐漸增多，陽性細(xì)胞數(shù)為(18.4±3.0)個(gè)(t=10.245，P<0.01)，且向移植針道周圍遷移可達(dá)1.1 cm；移植術(shù)后第28天陽性細(xì)胞逐漸減少并消失，其余各組無陽性細(xì)胞。

2.3 脊髓HE染色的光鏡觀察 Sham組大鼠脊髓灰質(zhì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞輪廓清楚，胞核清晰，部分細(xì)胞可見核仁，呈鳥眼樣。SCI組損傷后第1天，脊髓背側(cè)可見缺損區(qū)域，灰質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞，白質(zhì)中可見有腫脹的軸突和大量的空泡。SCI后第3天及第7天灰質(zhì)和白質(zhì)中部分細(xì)胞形態(tài)改變，突起減少，膠質(zhì)細(xì)胞增生。SCI后第14～28天，損傷范圍更為明確，脊髓變細(xì)并有空洞形成，膠質(zhì)細(xì)胞瘢痕形成。Brdu+NSCs組移植后第1天，脊髓中可見出血灶，灰質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞，尼氏體減少，細(xì)胞體積減??；第3天及第7天損傷達(dá)高峰，殘留細(xì)胞數(shù)量相對(duì)較多。SCI后第14天及第28天，損傷部位殘留細(xì)胞形態(tài)大致正常，尼氏體增加。Brdu+NSCs組與NSCs組之間比較病理學(xué)改變無明顯差異(見圖1、2)。

2.4 NSE免疫組織化學(xué)染色結(jié)果分析 NSE主要存在于神經(jīng)元的胞質(zhì)中。4組間各時(shí)間點(diǎn)NSE 免疫陽性細(xì)胞灰度值及陽性細(xì)胞數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Sham組各時(shí)間點(diǎn)間NSE 免疫陽性細(xì)胞灰度值及陽性細(xì)胞數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而SCI組、Brdu+NSCs組和NSCs組各時(shí)間點(diǎn)間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。其中SCI組、NSCs組和Brdu+NSCs組各時(shí)間點(diǎn)NSE 免疫陽性細(xì)胞灰度值及陽性細(xì)胞數(shù)與Sham組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；NSCs組和Brdu+NSCs組除第1天外余各時(shí)間點(diǎn)與SCI組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；Brdu+NSCs組與NSCs組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表2、表3)。NSE免疫陽性細(xì)胞灰度值及陽性細(xì)胞數(shù)與CSEP-P潛伏期均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.937，P<0.001；r=-0.956，P<0.001)。

表1 4組各時(shí)間點(diǎn)CSEP-P潛伏期比較Table 1 Comparison of the latency of CSEP-P wave at each time point in four groups

注：與Sham組比較，▲P<0.01；與SCI組比較，*P<0.01

圖1 SCI組移植后第7天(A)與移植后第28天(B)的HE染色(A：×100，B：×40)Figure 1 HE staining 7 d(A) and 28 d(B)after transplantation in SCI group

表2 4組各時(shí)間點(diǎn)NSE 免疫陽性細(xì)胞灰度值比較Figure 2 Comparison of the grey level of NSE immunostaining positive cells at each time point in four groups

注：與Sham組比較，▲P<0.01；與SCI組比較，*P<0.01

表3 4組各時(shí)間點(diǎn)NSE免疫陽性細(xì)胞數(shù)比較Table 3 Comparison of NSE immunostaining positive cells at each time point in four groups

注：與Sham組比較，▲P<0.01；與SCI組比較，*P<0.01

3 討論

中樞神經(jīng)再生問題一直是神經(jīng)科學(xué)界在理論研究和臨床實(shí)踐上感到十分困惑且尚未找到有效治療方法的重大難題。因而外傷導(dǎo)致中樞神經(jīng)的損害尤為嚴(yán)重，諸如腦皮質(zhì)功能受損或消失、SCI所致的癱瘓等[11-13]。NSCs是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中保持分裂和分化潛能的細(xì)胞，NSCs移植已成為人們探索治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷的新途徑，有研究報(bào)道，NSCs移植能在挫傷腦組織存活、遷移，并促進(jìn)宿主神經(jīng)元存活、局部軸突再生和改善腦挫傷大鼠神經(jīng)功能[14]。Brdu是胸腺苷類似物，可通過堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則整合到處于S期的原始干細(xì)胞雙鏈DNA中，在半保留復(fù)制過程中逐漸消減。本研究將Brdu標(biāo)記的NSCs移植到大鼠SCI區(qū)，并于移植后第7天、第14天檢測到逐漸增多的Brdu陽性細(xì)胞，移植細(xì)胞沿移植穿刺針道排列并發(fā)生了遷移，以上結(jié)果表明移植的NSCs可以存活于SCI區(qū)并向SCI區(qū)域發(fā)生了遷移，從而為下一步深入研究奠定了基礎(chǔ)。

CSEP是連續(xù)刺激外周感覺神經(jīng)纖維在中樞神經(jīng)系統(tǒng)誘發(fā)的綜合電位活動(dòng)，其變化可反映出脊髓神經(jīng)功能受損的程度，能夠客觀、量化和敏感地評(píng)價(jià)感覺功能障礙[15]。研究證實(shí)，脊髓后索和后外側(cè)索是CSEP傳導(dǎo)的主要通路。由于脊髓前后索相鄰，又為同一軟脊膜包繞，故CSEP也能間接反映前索情況，說明CSEP與后肢運(yùn)動(dòng)功能之間存在一定聯(lián)系。CSEP的波幅變化個(gè)體變異非常大，而潛伏期變化比較恒定，且與損傷程度及功能狀態(tài)的相關(guān)性也較大；潛伏期能夠反映神經(jīng)纖維傳導(dǎo)速度，潛伏期延長說明神經(jīng)纖維傳導(dǎo)阻滯，潛伏期縮短說明神經(jīng)纖維傳導(dǎo)速度增快，脊髓神經(jīng)傳導(dǎo)功能恢復(fù)[16]，故本研究只檢測了潛伏期的變化。結(jié)果表明，Brdu+NSCs組與NSCs組CSEP潛伏期除移植后第1天外其余各時(shí)間點(diǎn)均較SCI組顯著縮短，提示NSCs移植能夠促進(jìn)SCI后神經(jīng)傳導(dǎo)功能的恢復(fù)，可能的作用機(jī)制是NSCs移植入損傷脊髓后能從細(xì)胞結(jié)構(gòu)上與宿主融合，遷移分化成特定的神經(jīng)元，分泌細(xì)胞因子，一方面上調(diào)與軸索生長相關(guān)的基因，促進(jìn)受損的神經(jīng)元軸索再生；另一方面，與其他的神經(jīng)元建立突觸聯(lián)系，重建神經(jīng)環(huán)路，達(dá)到SCI的功能性恢復(fù)。

烯醇化酶普遍存在于哺乳動(dòng)物組織中，其同工酶以αα、ββ、γγ、αγ、αβ 5種形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，γγ型特異性地存在于神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中(線粒體內(nèi))，故命名為NSE[17]。NSE含量由高到低依次位于腦、脊髓、周圍神經(jīng)節(jié)，一旦缺血或受損，神經(jīng)元胞體和軸突的細(xì)胞膜完整性發(fā)生變化，使細(xì)胞內(nèi)大量蛋白質(zhì)(包括NSE)迅速進(jìn)入細(xì)胞間隙，胞內(nèi)的NSE減少，同時(shí)在腦脊液和血液內(nèi)可以檢測到NSE。本研究觀察到SCI組損傷后NSE免疫陽性細(xì)胞灰度值和陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，第3天開始緩慢恢復(fù)，同時(shí)伴有CSEP-P潛伏期的緩慢縮短，提示NSE的表達(dá)不僅能反映脊髓神經(jīng)損傷的程度，而且也參與了SCI后的修復(fù)過程，是脊髓感受傷害性反應(yīng)的內(nèi)源性保護(hù)劑，但這種自發(fā)的內(nèi)源性的保護(hù)作用是有限度的。Brdu+NSCs組與NSCs組除移植后第1天外，各時(shí)間點(diǎn)NSE免疫陽性細(xì)胞灰度值均高于SCI組，陽性細(xì)胞數(shù)亦多于SCI組，HE染色亦觀察到移植后第28天損傷部位殘留細(xì)胞形態(tài)大致正常，尼氏體增加。相關(guān)分析表明，NSE免疫陽性細(xì)胞灰度值越高、陽性細(xì)胞數(shù)越多，SCI后CSEP-P潛伏期縮短越明顯，結(jié)果提示，NSCs移植能明顯上調(diào)SCI后NSE的表達(dá)，并能通過促進(jìn)NSE的表達(dá)而縮短CSEP-P潛伏期，從而減輕SCI、保護(hù)神經(jīng)功能，進(jìn)而促進(jìn)大鼠后肢神經(jīng)功能障礙的恢復(fù)，具體的調(diào)控機(jī)制尚待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，體外培養(yǎng)的NSCs移植到SCI區(qū)域后可存活、遷移，且能明顯上調(diào)SCI后NSE的表達(dá)，并能通過促進(jìn)NSE的表達(dá)而縮短CSEP-P潛伏期，從而促進(jìn)大鼠后肢功能障礙的恢復(fù)。但以上結(jié)果與Sham組相比仍有一定差距，表明單純NSCs并不能得到十分滿意的脊髓功能恢復(fù)，因而尋求多種方法的聯(lián)合運(yùn)用治療SCI將是我們繼續(xù)研究的課題和努力的方向。

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