鴨傳染性漿膜炎檢測技術(shù)研究進(jìn)展

劉 偉黃 瑜

（1.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 福州 350000；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 福州 350013）

鴨傳染性漿膜炎最早發(fā)現(xiàn)于美國的紐約，其后在英國、加拿大等國發(fā)生，我國于1982年首次報(bào)道該病的存在，是危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要細(xì)菌性傳染病之一。臨診表現(xiàn)為困倦，眼與鼻孔有分泌物，排白色黏稠樣糞便，神經(jīng)癥狀如共濟(jì)失調(diào)、抽搐、頭頸震顫等，慢性病例可見斜頸。病理變化特點(diǎn)為纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、干酪性輸卵管炎和腦膜炎。臨診中該病易與鴨大腸桿菌病混淆，建立快速、及時(shí)、準(zhǔn)確的檢測方法具有重要意義，有助于治療藥物的選擇，減少經(jīng)濟(jì)損失。本文就鴨傳染性漿膜炎檢測技術(shù)的發(fā)展進(jìn)行綜述。

1 傳統(tǒng)的鴨傳染性漿膜炎檢測方法

1.1 病原的分離鑒定 初次分離時(shí)無菌采取病死鴨心血、肝臟或腦組織，在巧克力培養(yǎng)基和胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）平板上劃線，在含有二氧化碳的環(huán)境中培養(yǎng)，平板上會(huì)長出表面光滑的菌落，稍突起，圓形，直徑1～1.5 mm，若繼續(xù)培養(yǎng)菌落可達(dá)2 mm。鴨疫里默氏菌不能在普通瓊脂和麥康凱培養(yǎng)基上生長，在血瓊脂上不產(chǎn)生溶血。該菌革蘭氏染色為陰性小桿菌，無芽孢，有莢膜，瑞氏染色為兩極濃染。

細(xì)菌的分離鑒定需要時(shí)間較長，一般為2～3 d，并且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適于常規(guī)的臨床診斷，也不適合于大規(guī)模集約化生產(chǎn)中鴨疫里默氏菌病的檢測。

1.2 生化試驗(yàn) 該菌不發(fā)酵碳水化合物，但少數(shù)菌株能發(fā)酵葡萄糖、果糖、麥芽糖或肌醇，不產(chǎn)生吲哚和硫化氫，不還原硝酸鹽，不產(chǎn)生靛基質(zhì)和硫化氫，可液化明膠，接觸酶試驗(yàn)和尿素酶分解皆為陽性，西檬氏枸杞酸鹽利用陰性，氧化酶、過氧化氫酶、磷酸酶陽性。

1.3 血清學(xué)檢測方法

1.3.1 平板凝集試驗(yàn) 將陽性血清（適當(dāng)稀釋）與待檢菌懸液各一滴滴在玻片上混合，數(shù)分鐘后，出現(xiàn)顆粒狀或絮狀沉淀者為陽性。該試驗(yàn)用于鴨疫里默氏菌的血清型初步鑒定，操作簡便快速。但敏感性較低，還有可能發(fā)生不同血清型間的交叉反應(yīng)。

1.3.2 試管凝集試驗(yàn) 用來檢測血清中是否存在相應(yīng)抗體，測定抗體的效價(jià)，也用于對玻片凝集試驗(yàn)中表現(xiàn)交叉反應(yīng)的分離株進(jìn)行進(jìn)一步的檢測以及明確各型標(biāo)準(zhǔn)菌株之間的抗原關(guān)系［1］。操作簡單快速，敏感性較低。

1.3.3 間接血凝試驗(yàn) 高福等［2］報(bào)道了用瓊脂擴(kuò)散抗原致敏戊二醛化的綿羊紅血球來檢測血清中RA抗體，初步證明其敏感性較高。

1.4 瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗(yàn) 利用可溶性抗原和抗體在半固體凝膠中進(jìn)行反應(yīng)，當(dāng)抗原抗體分子相遇并達(dá)到相應(yīng)比例時(shí)，就會(huì)相互結(jié)合，凝集，出現(xiàn)白色的沉淀線，從而判定相應(yīng)的抗原和抗體。該試驗(yàn)用于鴨疫里默氏菌的血清型初步鑒定，敏感性也較低。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 檢測抗體常用的方法之一，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，相對于凝集試驗(yàn)和沉淀試驗(yàn)，ELISA具有更高的敏感性，從而適合于對血清中的RA抗體效價(jià)進(jìn)行檢測［1］。

Hatfie1d等（1987）建立了用ELISA方法來檢測鴨血清中抗RA抗體，但其抗原為2型RA的裂解菌體，并且應(yīng)用了酶標(biāo)記驢抗兔IgG，操作步驟和試驗(yàn)結(jié)果判定都較為復(fù)雜。

張鶴曉等［3］用裂解的1型RA菌體作為包被抗原，建立了特異性強(qiáng)，重復(fù)性良好且敏感性高的檢測鴨血清中RA1型抗體的ELISA方法。該方法可作為鴨傳染性漿膜炎感染的血清流行病學(xué)調(diào)查和對其疫苗免疫效果評價(jià)。方法如下：制備RA抗原，自制陽性血清和陰性血清，酶標(biāo)兔抗鴨IgG的制備，底物溶液的配制，洗滌液中NaC1濃度對非特異性吸附影響的測定，進(jìn)行ELISA。

蘇敬良等［4］、程龍飛等［5］、程安春等［6］又分別建立了檢測2型、3型、4型RA抗體的ELISA方法。Huang等［7］以 RA15型的OmpA 基因（P45）編碼 N-端的41 ku蛋白的編碼區(qū)進(jìn)行重組表達(dá)的蛋白建立間接ELISA方法，可以對多種RA的早期感染進(jìn)行有效的檢測。辜新貴等［8］根據(jù)克隆的RA1型的一種“保守的假定蛋白（conserved hypothetica1protein）”基因（ P25）（ GenBank Accessio No：EU072443）進(jìn)行重組表達(dá)，建立以重組P25蛋白為包被抗原的間接ELISA。P25蛋白是各種血清型RA間的共同抗原，所建立的ELISA可用于檢測不同血清型RA的感染。

1.6 免疫熒光技術(shù) 熒光免疫技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與熒光技術(shù)的敏感性相結(jié)合，對抗原或抗體進(jìn)行定性、定位或定量檢測。該技術(shù)具有簡便、快速、敏感和特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。檢測時(shí)取病料涂片、固定、然后進(jìn)行特異熒光染色、最后鏡檢，熒光著染的RA在黑暗的背景中呈橢圓形亮黃綠色環(huán)狀結(jié)構(gòu)，而大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌、沙門氏菌均不被熒光著染，整個(gè)視野暗淡、只隱約見到灰暗色的菌體［1］。該檢測方法快速、準(zhǔn)確的區(qū)分大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌和沙門氏菌。Marshe11最早報(bào)道了用該技術(shù)檢查患鴨組織或滲出物中的RA［1］。

免疫熒光技術(shù)檢測鴨疫里默氏菌病可分為直接熒光抗體技術(shù)和間接熒光抗體技術(shù)。郭玉璞等采用直接熒光抗體法來診斷急性病例。蘇敬良等［9］將間接熒光抗體技術(shù)用于急性死亡病例的檢測。朱琪等建立了間接免疫熒光抗體試驗(yàn)，對鴨疫里默氏菌病等進(jìn)行鑒別。張大丙等［1］的研究結(jié)果表明，直接和間接熒光抗體試驗(yàn)均無型特異性，卻均有種特異性，因此，都可用于菌種的鑒定，但在兩種試驗(yàn)中，都以同型抗原抗體之間出現(xiàn)較強(qiáng)的熒光，而異型之間出現(xiàn)的熒光易衰減［1］。

2 分子生物學(xué)檢測方法

分子生物學(xué)檢測相對于傳統(tǒng)的檢測方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡便、快速等優(yōu)點(diǎn)。

2.1 PCR技術(shù) PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是利用DNA在體外95℃時(shí)解旋，35℃時(shí)引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對結(jié)合，再調(diào)溫度至65℃左右DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖（5'-3'）的方向合成互補(bǔ)鏈。RA的血清型十分復(fù)雜，目前全世界已報(bào)道的血清型有21個(gè)，不同血清型之間沒有交叉保護(hù)作用。由于PCR方法并不針對病原菌的血清型，因此，能夠彌補(bǔ)血清型之間交叉反應(yīng)性低或沒有交叉反應(yīng)性的不足［10］。

胡清海等首先建立了PCR檢測鴨疫里默氏菌病的方法［11］。楊建遠(yuǎn)等［12］設(shè)計(jì)了特異性引物，建立了鴨疫里默氏菌病的快速準(zhǔn)確的PCR檢測方法。其研究根據(jù)GenBank中25株鴨疫里默氏菌（RA）的外膜蛋A（OmpA）基因序列，在其高度保守區(qū)設(shè)計(jì)了一對特異性引物，該P(yáng)CR檢測方法具有準(zhǔn)確、可靠、快速、經(jīng)濟(jì)之優(yōu)點(diǎn)，可用于RA的臨床檢測和流行病學(xué)調(diào)查。曲豐發(fā)等［13］以16SrDNA為靶基因建立特異性PCR快速檢測鴨疫里默氏菌的方法具有較好的特異性和敏感性。覃宗華等［14］采用細(xì)菌16SrRNA基因的通用引物，用PCR方法擴(kuò)增出鴨疫里默氏菌的部分16SrRNA基因，同時(shí)利用生物軟件對Gen－Bank收錄的鴨疫里默氏菌和大腸桿菌16SrRNA基因序列進(jìn)行分析后，設(shè)計(jì)了鴨疫里默氏菌和大腸桿菌的種特異性引物，并據(jù)此建立了一種能快速準(zhǔn)確鑒別診斷鴨疫里默氏菌病和大腸桿菌病的雙重PCR方法。

PCR檢測除16SrRNA基因序列分析法和外膜蛋白分析法外，還有RFLP和REP-PCR分析法。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（Rea1-Time Quantitative PCR）是近年發(fā)展起來的一種高敏感性檢測技術(shù)，它在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)放大檢測了信號，提高了檢測的敏感性；熒光定量PCR具有引物和探針的雙重特異性，故與傳統(tǒng)的PCR相比，特異性大為提高；熒光定量PCR結(jié)果相當(dāng)穩(wěn)定，無PCR后續(xù)操作步驟，降低產(chǎn)物污染的風(fēng)險(xiǎn)性，假陽性結(jié)果幾率降低。熒光定量PCR分DNA熒光結(jié)合染料法和特異性熒光探針法，熒光探針法特異性較高。

段澤等［15］根據(jù)其實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的鴨疫里默氏菌（RA）莢膜多糖蛋白基因序（DQ151838），設(shè)計(jì)和合成熒光定量PCR引物和探針，建立了檢測RA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法?？捎糜邙喴呃锬暇腥镜目焖僭\斷、流行病學(xué)調(diào)查和鴨產(chǎn)品的檢疫等。

謝永平等［16］的研究根據(jù)GenBank登錄的鴨疫里默氏菌外膜蛋白（OmpA）基因保守區(qū)序列，設(shè)計(jì)引物和探針，建立了直接檢測鴨疫里默氏菌的實(shí)時(shí)熒光定PCR快速方法。該方法應(yīng)用熱裂解法快速提取病料中RA中的DNA，與常規(guī)試劑提取方法比較，僅需30 min，縮短了DNA提取時(shí)間，應(yīng)用建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測臨床樣品，完成檢測僅需2 h，與試劑提取DNA方法需要5 h比較，顯著縮短了檢測周期，為臨床診斷RA提供了快速檢測方法，適用于臨床鴨疫里默氏菌病的快速檢測。

馮金牛等［17］根據(jù)RA的16SrRNA基因的保守序列設(shè)計(jì)了特異性引物和TaqMan探針，建立了檢測RA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。該方法只對RA的DNA有陽性擴(kuò)增信號，對 E.coli、P.multocida、Salmonella均無特異性反應(yīng)。所建立的FQ-PCR方法具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，標(biāo)準(zhǔn)曲線相對理想，具有較好的實(shí)用性，所建立方法的敏感性和特異性均高于普通PCR，且省時(shí)省力。

3 小結(jié)

鴨疫里默氏菌病是目前我國危害養(yǎng)鴨業(yè)最重要的傳染病之一，使我國養(yǎng)鴨戶遭受重大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙了中國養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展。以上是鴨疫里默氏菌病的檢測方法，各有特點(diǎn)，希望以后能有更多更好的檢測方法應(yīng)用于鴨疫里默氏菌病的檢測之中。

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