肌成纖維細(xì)胞的研究進(jìn)展及其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用

于天水 ，凌 躍 ，官大威

（1.中國政法大學(xué) 證據(jù)科學(xué)教育部重點實驗室，北京 100040；2.中國醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽 110001；3.南通市公安局崇川分局，江蘇 南通 226006）

肌成纖維細(xì)胞（myofibroblast）是一種表達(dá)平滑肌肌動蛋白的高度分化型細(xì)胞。肌成纖維細(xì)胞參與纖維化級聯(lián)反應(yīng)中纖維形成和細(xì)胞外基質(zhì)重塑兩個階段，因而在組織損傷修復(fù)中發(fā)揮了重要的作用。這一特性有望在皮膚損傷時間推斷中得到應(yīng)用。本文就肌成纖維細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征、生物學(xué)特性及其法醫(yī)學(xué)意義進(jìn)行闡述。

1 肌成纖維細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征

上世紀(jì)七十年代，Gabbiani等[1-2]通過電子顯微鏡技術(shù)首先對肉芽組織中的肌成纖維細(xì)胞進(jìn)行了描述。隨著對肌成纖維細(xì)胞的逐漸了解與認(rèn)識，Sappino等[3]發(fā)現(xiàn)，肌成纖維細(xì)胞同時具有平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞雙重特性，存在于多種正?；虿±斫M織中，且具有相似的形態(tài)學(xué)特征。

1.1 組織學(xué)特征

肌成纖維細(xì)胞通常為梭形或者星形，具有嗜酸性或者嗜雙色性。細(xì)胞核常呈鋸齒狀、凝縮，染色質(zhì)呈顆粒狀，散在分布，核仁明顯。

1.2 超微結(jié)構(gòu)特征

肌成纖維細(xì)胞主要有3個超微結(jié)構(gòu)特征：（1）應(yīng)力纖維（stress fibers）。在細(xì)胞膜下沿細(xì)胞長軸平行排列的束狀肌動蛋白微絲束，由β-/γ-肌動蛋白或α平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）組成[4]。（2）纖維連接復(fù)合體。細(xì)胞內(nèi)表面所形成的超成熟黏著斑，直徑為 8～30μm，由黏著斑蛋白（vinculin）、樁蛋白（paxillin）、張力蛋白（tensin）以及 αvβ3、α5β1整合素構(gòu)成，為肌成纖維細(xì)胞特有結(jié)構(gòu)。細(xì)胞內(nèi)的肌動蛋白微絲通過該特殊結(jié)構(gòu)與細(xì)胞外的纖維連接蛋白（fibronectin）相連接[5]。 （3）細(xì)胞連接。 如縫隙連接等[6]。

1.3 特殊染色鑒別

通常情況下，通過常規(guī)HE染色較難將肌成纖維細(xì)胞與其他種類的成纖維樣細(xì)胞（fibroblastic cell，F(xiàn)BC）相鑒別。2002年 Tomasek等[7]提出，α-SMA 免疫組織化學(xué)染色是鑒定肌成纖維細(xì)胞最可靠的特異性指標(biāo)。從此，α-SMA免疫組織化學(xué)染色成為鑒定肌成纖維細(xì)胞常規(guī)以及普遍認(rèn)可的形態(tài)學(xué)方法，陽性染色位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。如果應(yīng)用熒光顯微鏡或激光共聚焦掃描顯微鏡進(jìn)行觀察，陽性信號于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈細(xì)絲狀排列。

2 肌成纖維細(xì)胞的生物學(xué)特性

在不同器官中，多種類型細(xì)胞在多因素作用下可以分化為肌成纖維細(xì)胞。正常情況下，肌成纖維細(xì)胞最后主要以凋亡的方式逐漸消失，不能繼續(xù)分化，是一種終末型細(xì)胞。

2.1 肌成纖維細(xì)胞的來源、分化和調(diào)節(jié)

2.1.1 成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞

目前研究[7]表明，在皮膚、肺和腎等多器官損傷修復(fù)的纖維化發(fā)展階段，部分肌成纖維細(xì)胞來源于成纖維細(xì)胞。成纖維細(xì)胞通過兩個過程才能分化為肌成纖維細(xì)胞。第一，當(dāng)損傷后結(jié)締組織所承受的機械性張力（mechanical tension）或者炎癥反應(yīng)引起結(jié)締組織微環(huán)境改變時，損傷周邊區(qū)局部聚集的成纖維細(xì)胞會轉(zhuǎn)化為原始肌成纖維細(xì)胞（proto-myofibroblast）。原始肌成纖維細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)成熟黏著斑和由β-/γ-肌動蛋白所構(gòu)成的應(yīng)力纖維（stress fiber）。第二，在機械性張力、細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)共同作用下，細(xì)胞內(nèi)成熟黏著斑分化為黏著斑，接著α-SMA黏集到應(yīng)力纖維上，導(dǎo)致原始肌成纖維細(xì)胞最終轉(zhuǎn)變?yōu)榉只图〕衫w維細(xì)胞（differentiated myofibroblast）。此外還表達(dá)其他一些平滑肌分化的標(biāo)記物，如結(jié)蛋白（desmin）等。

上述過程表明，由于肌成纖維細(xì)胞主要來源于成纖維細(xì)胞，故機械性張力、細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)3個因素共同影響著肌成纖維細(xì)胞的分化。

2.1.2 循環(huán)纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞

1994年Bucala等[8]發(fā)現(xiàn)一類具有成纖維細(xì)胞特性的白細(xì)胞亞群，稱之為循環(huán)纖維細(xì)胞（circulating fibrocytes）。它們是骨髓來源的間充質(zhì)前體細(xì)胞，約占外周血白細(xì)胞的0.1%～0.5%。在體外，循環(huán)纖維細(xì)胞可以通過血液中單核細(xì)胞的培養(yǎng)獲得，既表達(dá)造血細(xì)胞表面抗原CD34，白細(xì)胞共同抗原CD45，單核細(xì)胞系標(biāo)記物 CD11、CD13、CD32和 CD64，又分泌細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），如Ⅰ、Ⅲ型膠原，纖維連接蛋白和波形蛋白（vimentin）。

越來越多的證據(jù)顯示，在損傷愈合期間或在一些纖維化損害中，循環(huán)纖維細(xì)胞可以出現(xiàn)在纖維灶的周圍，并且轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞。定位于過敏性哮喘患者支氣管黏膜膠原沉積區(qū)域的肌成纖維細(xì)胞可能來源于循環(huán)纖維細(xì)胞，研究人員[9]進(jìn)一步對熒光標(biāo)記的循環(huán)纖維細(xì)胞在過敏性哮喘小鼠中進(jìn)行追蹤研究，間接證實了上述結(jié)果。

2.1.3 上皮細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞

在一些情況下，上皮細(xì)胞會失去極性和細(xì)胞連接，并且經(jīng)歷細(xì)胞骨架重塑，不表達(dá)其特異性標(biāo)志物E-鈣粘素（E-cadherin）和緊密連接蛋白-1（zonula occluden-1），而表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物成纖維細(xì)胞特異性蛋白1和α-SMA，即上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變（epithelialmesenchymal transition，EMT）。

有學(xué)者研究[10-12]腎小管上皮細(xì)胞系和腎纖維化模型發(fā)現(xiàn)，TGF-β、高級糖基化終末產(chǎn)物以及CTGF參與調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程。另外，對特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）的肺泡上皮細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)和TGF-β1（100pmol/L）長時間作用后，肺泡上皮細(xì)胞會出現(xiàn)成纖維樣細(xì)胞的形態(tài)，并且α-SMA、Ⅰ型膠原、波形蛋白和結(jié)蛋白表達(dá)增加，上皮細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)減少。IPF患者肺組織標(biāo)本中肺泡上皮細(xì)胞共表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)志物和α-SMA，所以IPF中的肌成纖維細(xì)胞可能來源于上皮細(xì)胞[13]。實驗性小鼠肺纖維化動物模型進(jìn)一步確定EMT存在于體內(nèi)，參與了纖維形成[14]。

2.2 肌成纖維細(xì)胞在損傷修復(fù)中的作用

2.2.1 收縮功能

肌成纖維細(xì)胞能夠收縮是因為表達(dá)具有收縮性質(zhì)的α-SMA，并且超成熟黏著斑大小直接影響肌成纖維細(xì)胞的收縮強度，每μm2產(chǎn)生6.6～12.6 nN的收縮力。肌成纖維細(xì)胞通過縫隙連接和超成熟黏著斑在細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間傳遞收縮力，誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)收縮和重塑，使整個收縮過程達(dá)到同步化[6]。在皮膚創(chuàng)傷愈合過程中，肌成纖維細(xì)胞出現(xiàn)在創(chuàng)面收縮階段，減少創(chuàng)口組織的表面面積，有利于上皮再形成，以促進(jìn)創(chuàng)口的愈合。另外，Gabbiani等[15]在掌筋膜攣縮綜合征和足底筋膜攣縮綜合征患者的病變腱膜組織中發(fā)現(xiàn)了具有收縮性質(zhì)的肌成纖維細(xì)胞，其收縮功能對上述綜合征的發(fā)病起到重要作用。

2.2.2 分泌功能

肌成纖維細(xì)胞具有發(fā)達(dá)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，為了代替壞死的組織，肌成纖維細(xì)胞分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)，包括膠原纖維（Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ）、蛋白多糖、金屬蛋白酶組織抑制劑-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）、TIMP-2 等。 體外細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，肌成纖維細(xì)胞和成纖維細(xì)胞一樣可以分泌Ⅰ型和Ⅲ型膠原，其比例也基本是1∶1，但膠原合成量是成纖維細(xì)胞的3倍[16]。羊胚胎損傷愈合研究證實從孕早期（75d）到孕晚期（100d和 120 d）過程中，羊胚胎傷口中肌成纖維細(xì)胞從無到有，細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，羊胚胎損傷修復(fù)的形式則從無瘢痕轉(zhuǎn)變?yōu)轳：坌纬蒣17]。這些研究說明肌成纖維細(xì)胞通過分泌細(xì)胞外基質(zhì)參與組織損傷修復(fù)和器官纖維化。

2.3 肌成纖維細(xì)胞的歸宿

在正常損傷修復(fù)后期肉芽組織轉(zhuǎn)變?yōu)轳：劢M織的過程中，肌成纖維細(xì)胞內(nèi)編碼凋亡蛋白的基因開始表達(dá)，是肌成纖維細(xì)胞最后消失的主要機制。有學(xué)者[4]發(fā)現(xiàn)大鼠皮膚損傷15d之后許多肌成纖維細(xì)胞發(fā)生凋亡，直至傷后30d消失。Desmoulière等[18]在大鼠皮膚損傷愈合過程中利用原位末端標(biāo)記片段DNA方法檢測肌成纖維細(xì)胞的凋亡率，發(fā)現(xiàn)傷后16 d凋亡細(xì)胞顯著增加，傷后20d達(dá)到高峰，約9%～12%的細(xì)胞發(fā)生凋亡，到傷后60d則無陽性染色。電子顯微鏡結(jié)果顯示，含有吞噬溶酶體的巨噬細(xì)胞位于凋亡細(xì)胞的周圍，提示巨噬細(xì)胞的吞噬作用可能是清除凋亡小體的主要途徑。但是引起肌成纖維細(xì)胞凋亡的原因目前還不十分清楚，可能與細(xì)胞外基質(zhì)重塑時基質(zhì)金屬蛋白酶-1（matrix metalloproteinase-1，MMP-1）、MMP-2和TIMP等酶類含量變化有關(guān)[19]。Murphy等[20]進(jìn)一步證實，TIMP-1滅活基質(zhì)金屬蛋白酶能夠抑制肝肌成纖維細(xì)胞的凋亡。還有研究[21-22]表明，TGF-β1通過激活p38MAPK-PI3K-AKT信號通路和抑制IL-1-iNOS表達(dá)，從而阻止肌成纖維細(xì)胞凋亡，所以創(chuàng)面愈合后創(chuàng)口內(nèi)TGF-β1的減少可能也是引起肌成纖維細(xì)胞凋亡的一個原因。

3 肌成纖維細(xì)胞的法醫(yī)學(xué)意義

Darby等[4]通過電子顯微鏡技術(shù)和免疫組織化學(xué)方法研究α-SMA在大鼠開放性創(chuàng)傷愈合肉芽組織中的表達(dá)情況，證實從傷后6 d開始α-SMA陽性染色逐漸增強，15d達(dá)到高峰，此后表達(dá)減弱，至30d沒有陽性表達(dá)。上述實驗結(jié)果提示，肌成纖維細(xì)胞的出現(xiàn)具有一定的時間規(guī)律性，為其在法醫(yī)學(xué)損傷時間推斷方面的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。Betz等[23]對人類皮膚損傷后存活不同時間的組織標(biāo)本進(jìn)行組織學(xué)和免疫組織化學(xué)檢測，發(fā)現(xiàn)傷后5 d內(nèi)典型肉芽組織尚未形成，肌成纖維細(xì)胞也未出現(xiàn)，但是從傷后5d至2個月的部分標(biāo)本中可以找到肌成纖維細(xì)胞，所以在損傷皮膚中檢測出α-SMA陽性的肌成纖維細(xì)胞，可以認(rèn)定皮膚損傷時間大約5d以上。近年來國內(nèi)也有關(guān)于肌成纖維細(xì)胞在皮膚損傷時間推斷方面的研究報道。研究人員利用免疫組織化學(xué)染色方法觀察小鼠皮膚切創(chuàng)后各個時間段α-SMA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)傷后1d α-SMA陽性細(xì)胞率開始增加，3 d陽性細(xì)胞率達(dá)高峰，傷后5～14 d陽性細(xì)胞率逐漸下降[24]。然而來源于循環(huán)纖維細(xì)胞的CD45+/α-SMA+肌成纖維細(xì)胞于傷后5d才開始出現(xiàn)在新生的肉芽組織中，并于傷后7d數(shù)量達(dá)到高峰[25]。國內(nèi)研究的表達(dá)時間均比Darby等[4，23]研究結(jié)果有所提前，其原因可能是所選用的實驗對象種屬不同，小鼠損傷愈合過程要比大鼠和人類迅速；其次可能是由于免疫組織化學(xué)染色方法不同，前人多利用ABC法，而當(dāng)今SP法和免疫熒光技術(shù)敏感性更高。

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