幼兒頰黏膜脫落細(xì)胞鈣離子含量與齲病活躍性檢測(cè)結(jié)果的關(guān)系

魏利敏 王劍鋒 石四箴

幼兒頰黏膜脫落細(xì)胞鈣離子含量與齲病活躍性檢測(cè)結(jié)果的關(guān)系

魏利敏 王劍鋒 石四箴

目的 探討幼兒頰粘膜脫落細(xì)胞鈣離子含量與幼兒患齲狀況以及幼兒齲病活躍性檢測(cè)結(jié)果的關(guān)系。方法將50例3～5歲幼兒根據(jù)齲蝕指數(shù)分為兩組：齲病高危組26例、無(wú)齲組24例。采用Dentocult SM、Dentocult LB、Cariostat、SCAT 4種方法對(duì)幼兒進(jìn)行齲病活躍性檢測(cè)。取幼兒頰黏膜脫落細(xì)胞，F(xiàn)luo-3染色，用激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的熒光強(qiáng)度值，統(tǒng)計(jì)分析其與齲病活躍性的關(guān)系。結(jié)果高危組幼兒Ca2+熒光強(qiáng)度低于無(wú)齲組（P＜0.01）；高危組幼兒頰黏膜內(nèi)Ca2+的熒光強(qiáng)度與dft、CSI均呈直線負(fù)相關(guān)關(guān)系（均P＜0.01）；3歲組Ca2+熒光強(qiáng)度高于5歲組（P＜0.05）；Ca2+熒光強(qiáng)度分別與Dentocult SM、Dentocult LB及SCAT結(jié)果呈等級(jí)負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.05或0.01）。結(jié)論3～5歲幼兒頰黏膜鈣離子熒光強(qiáng)度與患齲狀況具有一定的相關(guān)性，齲壞程度重則細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度低。幼兒頰黏膜細(xì)胞內(nèi)鈣離子的熒光強(qiáng)度可作為篩選齲病易感兒童的一項(xiàng)參考指標(biāo)。

頰黏膜細(xì)胞 鈣離子 激光掃描共聚焦顯微鏡 熒光強(qiáng)度 齲活躍性

Association of calcium ion levels in buccal cells with caries activity in children

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the association of calcium ion levels in buccal cells with caries activity in children.MethodsFifty children aged 3～5 were enrolled in the study,including 26 with high caries-susceptibility and 24 caries-free children.Dentocult SM,Dentocult LB,Cariostat and SCAT tests were applied on all individuals.The buccal surface cells were collected and stained with Fluo-3,the fluorescent intensity of calcium ions was measured by laser scanning confocal microscope.ResultsThe fluorescent intensity of calcium ions in caries-free group was higher than that in high caries-susceptibility group(P＜0.01).The fluorescent intensity was negatively correlated with dft,CSI indexes in high caries-susceptibility group (P＜0.01).The fluorescent intensity was higher in age group 3 than that in age group 5 (P＜0.05).Negative spearman correlations were found between fluorescent intensity and Dentocult SM,Dentocult LB,SCAT test results(P＜0.01,P＜0.01,P＜0.05 respectively).ConclusionThe calcium ion levels in buccal cells are negatively correlated with caries status in children aged 3～5,which suggests that fluorescent intensity of calcium ions in buccal cells might be used as an indicator to screen high caries-susceptibility children.

【 Key words】Buccal cell Calciumions Fluorescent intensity Caries activity test Laser scanning confocal microscope(LSCM)

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 2011—09-10隨機(jī)抽取某幼兒園幼兒50例（3～5歲，其中3歲幼兒14例，4歲幼兒27例，5歲幼兒9例），乳牙列均完整，無(wú)口腔急性疾病、急性系統(tǒng)性感染性疾病、慢性疾病、代謝性疾病、遺傳性疾病及發(fā)育異常。檢查幼兒的全口牙齒并記錄，患齲牙標(biāo)明齲蝕牙面，計(jì)算齲補(bǔ)牙數(shù)（dft）及齲蝕指數(shù)（CSI）。以齲患程度為指標(biāo)將受檢兒童分為無(wú)齲組（dft=0，CSI=0）24例，男14例，女10例，年齡3～5歲，平均3.7歲；高危組（dft≥5，CSI≥10）26例，男18例，女8例，年齡3～5歲，平均4.1歲。兩組幼兒性別及年齡的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

1.2 齲病活躍性檢測(cè) 分別用Dentocult SM（芬蘭O-rion Diagnostisca公司）、Dentocult LB（芬蘭Orion Diagnostisca公司）、Cariostat（日本三金株式會(huì)社）及SCAT（中國(guó)石四箴研制）4種試劑盒對(duì)受試幼兒進(jìn)行唾液鏈球菌計(jì)數(shù)、唾液乳酸桿菌計(jì)數(shù)及菌斑產(chǎn)酸能力檢測(cè)[7-8]，所有操作嚴(yán)格遵循試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.3 頰黏膜細(xì)胞的采集、處理 采集前50ml 0.9%氯化鈉溶液漱口3次，受檢兒平坐，頭稍仰，測(cè)試者左手以口鏡拉開(kāi)小兒口角，右手執(zhí)白色塑料小刮片。適當(dāng)用力，刮取頰黏膜脫落細(xì)胞，采樣面積約3.0mm2。將小刮片置于內(nèi)有1.0ml PBS（pH值7.4）的Eppendorf管中洗3～5下，使細(xì)胞溶于儲(chǔ)存液。在含有細(xì)胞的Eppendorf管內(nèi)加入配制好的熒光染料Fluo-3/AM（濃度為1μmol/L）10μl，37℃二氧化碳培養(yǎng)箱孵育30min。而后1 000r/min離心分離5 min，連續(xù)3次。用移液管小心吸出上層液，最后一次吸去上層液后，加入1ml PBS，震蕩器上震蕩1min，將含細(xì)胞的PBS溶液倒入放置于37℃恒溫工作臺(tái)上的培養(yǎng)皿內(nèi)靜置5min，待細(xì)胞下沉后收集。

1.4 鈣離子熒光強(qiáng)度測(cè)定 采用CLSM（LSM510型，德國(guó)ZEISS公司生產(chǎn)）測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子的熒光強(qiáng)度。每例樣本選取3個(gè)視野，3個(gè)視野內(nèi)細(xì)胞數(shù)之和不少于50個(gè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料均以表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用q檢驗(yàn)，相關(guān)性采用直線相關(guān)與回歸分析及Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1兩組鈣離子熒光強(qiáng)度比較 無(wú)齲組、高危組鈣離子熒光強(qiáng)度分別為93.80±9.73、54.03±11.10，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.421，P＜0.01）。兩組幼兒鈣離子熒光圖見(jiàn)圖1-2。

圖1 無(wú)齲組鈣離子熒光圖像

圖2 高危組鈣離子熒光圖像

2.2 不同年齡幼兒鈣離子熒光強(qiáng)度的比較 3、4、5歲幼兒鈣離子熒光強(qiáng)度分別為 49.25～113.90（83.92± 21.79）、34.98～101.91（71.99±21.36）、35.38～96.32（59.68± 21.41），3歲幼兒鈣離子熒光強(qiáng)度明顯高于5歲幼兒（P＜0.05），而3歲與4歲、4歲與5歲幼兒間鈣離子熒光強(qiáng)度的差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 高危組鈣離子熒光強(qiáng)度與dft、CSI的直線相關(guān)與回歸分析 高危組鈣離子熒光強(qiáng)度與dft、CSI明顯相關(guān)（r=-0.457、-0.511，P＜0.05或0.01），其直線回歸散點(diǎn)圖見(jiàn)圖3-4。

圖3 高危組鈣離子熒光強(qiáng)度值與dft直線回歸散點(diǎn)圖

圖4 高危組鈣離子熒光強(qiáng)度值與CSI直線回歸散點(diǎn)圖

2.4 鈣離子熒光強(qiáng)度與齲病活躍性檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性 鈣離子熒光強(qiáng)度與Dentocult SM，Dentocult LB及SCAT實(shí)驗(yàn)結(jié)果高度相關(guān)（r=0.534、0.420、0.431，均P＜0.01），但與Cariostat檢測(cè)結(jié)果無(wú)相關(guān)性（r=0.193，P＞0.05）。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，無(wú)齲組頰黏膜細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度顯著高于高危組，可見(jiàn)頰黏膜細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度和患齲狀況存在一定的關(guān)系。唾液作為頰黏膜細(xì)胞生存的外環(huán)境，其pH值、礦物質(zhì)離子濃度、不飽和脂肪酸含量等理化特性和頰黏膜細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度處于一種動(dòng)態(tài)聯(lián)系中[9-10]。無(wú)齲組唾液中的鈣離子濃度較高，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外鈣離子濃度在一個(gè)更高的水平保持平衡；相反，高危組唾液中鈣離子濃度較低，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外鈣離子濃度在一個(gè)較低的水平保持平衡[11]。

另外，本文結(jié)果還顯示，3歲幼兒頰黏膜細(xì)胞鈣離子熒光強(qiáng)度高于5歲幼兒，推測(cè)其可能原因如下：（1）齲病嚴(yán)重程度不同，5歲幼兒齲病病程長(zhǎng)于3歲幼兒，早期的齲齒發(fā)展到5歲時(shí)往往已經(jīng)是殘根殘冠，而3歲幼兒的齲齒多是1年之內(nèi)的新發(fā)齲齒[12]。（2）5歲幼兒患齲牙數(shù)可能多于3歲幼兒。（3）既往研究發(fā)現(xiàn)，口腔變形鏈球菌于19～31個(gè)月時(shí)定居幼兒口腔，并且隨著年齡的增加，細(xì)菌數(shù)量也不斷增加[13]。由此可以推測(cè)，5歲幼兒唾液中變形鏈球菌產(chǎn)酸能力高于3歲幼兒，唾液pH值低于3歲幼兒，一定程度上影響了鈣離子熒光強(qiáng)度，但是否是導(dǎo)致3歲與5歲幼兒細(xì)胞鈣離子熒光強(qiáng)度不同的因素，尚待進(jìn)一步探討[14]。此外，口腔中大部分乳酸桿菌附著于頰黏膜表面，而乳酸桿菌具有很強(qiáng)的代謝產(chǎn)酸能力，是否會(huì)導(dǎo)致頰黏膜部位的pH值低于口腔其它部位，也尚待驗(yàn)證[15]。

綜上所述，頰黏膜細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度可作為齲病活躍性的一個(gè)檢測(cè)指標(biāo)，為幼兒齲病活躍性檢測(cè)提供了一條新途徑。

[1]石四箴.兒童口腔病學(xué)[M].3版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2008:80-107.

[2] Nishimura M,Oda T,Kariya N,et al.Using a caries activity test to predict caries risk in early childhood[J].J Am Dent Assoc,2008,139 (1):63-71.

[3]Vacca S A M,Scott-Anne K M,Whelehan M T,et al.Salivary glucosyltransferase B as a possible marker for caries activity[J]. CariesRes,2007,41(6):445-450.

[4] Bhasin S,Sudha P,Anegundi R T.Chair side simple caries activity test:Oratest[J].J Indian Soc Pedod Prev Dent,2006,24(2):76-79.

[5] Clarke P,Fraser-Lee N J,Shimono T.Identifying risk factors for predicting caries in school-aged children using dental health information collected at preschool age[J].ASDC J Dent Child,2001, 68(5-6):373-378.

[6] 李楠,尹嶺,蘇振倫.激光掃描共聚焦顯微術(shù)[M].北京人民軍醫(yī)出版社, 1997:30-69.

[7] 代巧榮,石四箴.兒童齲病危險(xiǎn)性相關(guān)因素研究進(jìn)展[J].中國(guó)學(xué)校衛(wèi)生, 2010,31(4):504-505.

[8]韓曉蘭,顏雨春,高永梅,等.安徽省12歲兒童齲病及口腔衛(wèi)生狀況抽樣調(diào)查結(jié)果分析[J].中國(guó)學(xué)校衛(wèi)生,2008,29(1):1008-1009.

[9]Tayab T,Rai K,Kumari A V.Evaluating the physicochemical properties and inorganic elements of saliva in caries-free and caries-active children:an invivo study[J].Eur J Paediatr Dent,2012, 13(2):107-112.

[10] Ravishankar T L,Yadav V,Tangade P S,et al.Effect of consuming different dairy products on calcium,phosphorus and pH levels of human dental plaque:a comparative study[J].Eur Arch Paediatr Dent,2012,13(3):144-148.

[11]Tanaka K,Miyake Y,Sasaki S,et al.Dairy products and calcium intake during pregnancy and dental caries in children[J].Nutr J, 2012,17(11):33-36.

[12] Shetty V,Hegde A M,Nandan S,et al.Caries protective agents in human milk and bovine milk:an in vitro study[J].J Clin Pediatr Dent,2011,35(4):389-392.

[13] Preethi B P,Reshma D,Anand P.Evaluation of flow rate,pH, buffering capacity,calcium,total proteins and total antioxidant capacity levels of saliva in caries free and caries active children: an in vivo study[J].Indian J Clin Biochem,2010,25(4):425-428.

[14] Bayrak S,Okte Z,Fidanci U R.Relationship between caries and dental plaque composition[J].Am J Dent,2011,24(1):45-48.

[15] Vijayaprasad K E,Ravichandra K S,Vasa A A,et al.Relation of salivary calcium,phosphorus and alkaline phosphatase with the incidence of dental caries in children[J].J Indian Soc Pedod Prev Dent,2010,28(3):156-161.

2012-12-13）

（本文編輯：歐陽(yáng)卿）

325027 溫州醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院（魏利敏、王劍鋒）；同濟(jì)大學(xué)兒童口腔醫(yī)學(xué)研究所（石四箴）

王劍鋒，E-mail：dentwjf@163.com