吉西他濱聯(lián)合槲皮素對(duì)胰腺癌細(xì)胞Panc-1凋亡的影響研究

周小紅 徐飛龍 陳建

吉西他濱聯(lián)合槲皮素對(duì)胰腺癌細(xì)胞Panc-1凋亡的影響研究

周小紅 徐飛龍 陳建

目的 研究吉西他濱聯(lián)合槲皮素抑制胰腺癌細(xì)胞Panc-1增殖，促進(jìn)其凋亡的效果。 方法 設(shè)立槲皮素（終濃度為50μM）、吉西他濱（50μg/ml）、吉西他濱聯(lián)合槲皮素和對(duì)照組4組，MTS法檢測(cè)藥物對(duì)Panc-1細(xì)胞凋亡的影響，流式細(xì)胞儀檢測(cè)聯(lián)合藥物處理對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響，最后應(yīng)用熒光定量PCR法測(cè)定凋亡相關(guān)基因BCL-2家族蛋白的相對(duì)表達(dá)。 結(jié)果 吉西他濱聯(lián)合槲皮素后，對(duì)胰腺癌促凋亡效果增強(qiáng)，同時(shí)改變細(xì)胞周期，使其S期減少，BCL-2家族促凋亡基因表達(dá)上調(diào)。 結(jié)論 槲皮素能夠顯著增強(qiáng)吉西他濱抑制胰腺癌惡性增殖的作用。

槲皮素 吉西他濱 胰腺癌細(xì)胞 增殖 凋亡

胰腺癌是高病死率腫瘤，新診斷患者的平均生存時(shí)間為9～12個(gè)月，即使通過(guò)外科手術(shù)切除，患者平均生存時(shí)間最長(zhǎng)只有18個(gè)月[1-2]。胰腺癌高病死率的原因可能是患者發(fā)病后，腫瘤細(xì)胞傾向于局部組織浸潤(rùn)及散布到全身，基本上患者在診斷同時(shí)或不久之后即發(fā)生全身性轉(zhuǎn)移[3]。至今仍缺乏效果明顯的藥物，也是胰腺癌高致死率的重要原因之一。

吉西他濱（美國(guó)禮來(lái)公司）被認(rèn)為是一線抗胰腺癌的化療藥物，但是其效果仍然不是十分理想。據(jù)相關(guān)報(bào)道，患者使用后其平均生存時(shí)間大約可以延長(zhǎng)6個(gè)月左右，這與理想治愈效果相距甚遠(yuǎn)[4-5]，急需新的藥物或新的治療方案來(lái)改善目前窘境。槲皮素（Quercetin）化學(xué)名稱為3，3′，4′，5，7-五羥黃酮，是最常見的黃酮類物質(zhì)之一，作為植物的二級(jí)代謝物，具顯著抗氧化和抗腫瘤的作用。本研究即基于此，探討在體外槲皮素聯(lián)合吉西他濱是否能夠增強(qiáng)治療胰腺癌的作用。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑 胰腺癌細(xì)胞Panc-1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)（上海），槲皮素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，吉西他濱購(gòu)自美國(guó)禮來(lái)公司，細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI 1640及青-鏈霉素購(gòu)自杭州吉諾生物醫(yī)藥科技有限公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，細(xì)胞培養(yǎng)耗材購(gòu)自美國(guó)Corning公司，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（Annextin-V/PI）和細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（PI）購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，RNA抽提用Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen（上海）公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR green熒光定量試劑盒購(gòu)自日本TAKARA（大連）公司，MTS試劑購(gòu)自美國(guó)Promega公司等。

流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司），酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司），二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司），倒置顯微鏡（日本Olympus公司）等。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和傳代 胰腺癌細(xì)胞Panc-1在含有10%胎牛血清和1%雙抗（青-鏈霉素）的RPMI 1640培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞匯合度約為80%～90%時(shí)，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗一遍后加入1ml胰酶消化室溫消化2～5min，加入完全培養(yǎng)基，吹打完全成單細(xì)胞懸液，并轉(zhuǎn)至其他細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。1.3 方法

1.3.1 吉西他濱聯(lián)合槲皮素抑制Panc-1細(xì)胞增殖 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胰腺癌細(xì)胞Panc-1胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，以5×103/孔的細(xì)胞數(shù)量接種入96孔板，孵育6～10h之后，分別加入槲皮素（終濃度為50μM）[6]、吉西他濱（50μg/ml）[7]、槲皮素+吉西他濱（終濃度分別為50μM和50μg/ml），設(shè)置空白對(duì)照且各做6個(gè)復(fù)孔。于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72、96h后，每孔加入20μl的MTS溶液，培養(yǎng)箱37℃，5%CO2孵育2h之后，在酶標(biāo)儀A490nm下，測(cè)得吸光值。相同實(shí)驗(yàn)，平行重復(fù)3次。

1.3.2 利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)吉西他濱聯(lián)合槲皮素導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Panc-1細(xì)胞胰酶消化，以5×105個(gè)細(xì)胞/孔鋪于6孔板中，培養(yǎng)24h后分3組：槲皮素組、吉西他濱組和槲皮素+吉西他濱聯(lián)合組，分別加入相應(yīng)藥物，并設(shè)空白對(duì)照組。待到細(xì)胞刺激48～72h后，將細(xì)胞培養(yǎng)液吸出，用PBS清洗細(xì)胞，然后加入適量不含有EDTA的0.25%胰酶，室溫下消化細(xì)胞2～5min，加入適量體積的完全培養(yǎng)基中和胰酶作用，輕柔反復(fù)吹打，直至細(xì)胞分散完全，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入離心管內(nèi)，以1 500r/min速度離心5min，棄上清液，收集細(xì)胞。然后，加入PBS重懸細(xì)胞，再次離心后棄上清液，用Annexin-V/PI細(xì)胞凋亡試劑中binding buffer適當(dāng)體積重懸細(xì)胞（保持細(xì)胞濃度為1×106/ml左右），加入10μl的Annexin-V溶液冰上靜止20min，最后加入10μl的PI溶液，300目濾網(wǎng)過(guò)濾，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次。

1.3.3 細(xì)胞周期的影響 方法同上，將6孔板中的4組細(xì)胞：槲皮素組、吉西他濱組、槲皮素+吉西他濱聯(lián)合組和對(duì)照組分別加入相應(yīng)藥物并處理72h后，收集細(xì)胞，離心，PBS重懸并離心，棄上清液，最后重懸于-20℃預(yù)冷的75%冰乙醇中固定30min以上。2 000r/min離心5min，加入PBS重懸，再次離心，棄上清液，然后加入含有RNA酶的PBS重懸細(xì)胞，37℃水浴20min，然后按照細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒的要求加入PI試劑染色，后濾網(wǎng)過(guò)濾，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 凋亡相關(guān)基因的表達(dá)檢測(cè)

1.3.4.1 RNA抽取 方法同樣，將鋪于6孔板中的4組細(xì)胞：槲皮素組、吉西他濱組、槲皮素+吉西他濱聯(lián)合組和對(duì)照組，藥物處理72h后，棄掉培養(yǎng)基，加入PBS洗3次，吸干，每孔加入1 000μlTrizol，反復(fù)吹打，將細(xì)胞溶解充分并移入1.5ml離心管中靜止3～5min，加入200μl氯仿，振蕩器劇烈震蕩后12 000r/min，4℃離心10min，將上清液移入新的離心管中，并加入等體積的異丙醇，混合均勻，室溫靜止30min沉淀RNA，12 000r/min，4℃離心15min，倒掉上清液，用DEPC水配置的75%乙醇洗1次，風(fēng)干并溶于DEPC水中，定量。

1.3.4.2 逆轉(zhuǎn)錄 應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照生產(chǎn)商的說(shuō)明書操作，具體步驟如下：在冰浴的PCR中加入如下反應(yīng)混合物[小于1μg的模板RNA、1μl的Oligo（dT）、H2O（RNAase free）至12μl]，反應(yīng)混合物在70℃水浴5min后，冰浴30s，短暫離心數(shù)秒。將試管冰浴，再加入如下組分：5×Reaction Buffer（4μl）、RNase Inhibitor（1μl）和dNTP Mix（2μl），逆轉(zhuǎn)錄酶（1μl），混勻并離心，反應(yīng)混合物42℃水浴60min。在70℃加熱10min結(jié)束反應(yīng)，置冰上進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)或冷凍保存。

1.3.4.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的步驟是：第一步，95℃10min；第二步，95℃15s，60℃1min，重復(fù)40循環(huán)；第三步，溶解曲線從60℃～95℃每0.5℃采集信號(hào)一次。定量PCR的引物分別為：BAX-F：3′-GATGCGTCCACCAAGAAGCT-5′，BAX-R：3′-CGGCCCCAGTTGAAGTTG-5′；BCL2L1-F：3′-ACCCCAGGGACAGCATATCA-5′，BCL2L1-R：3′-TGCGATCCGACTCACCAATA-5′；BCL2-F：3′-TCCGCATCAGGAAGGCTAGA-5′，BCL2-R：3′-AGGACCAGGCCTCCAAGCT-5′；BIK-F：3′-CTTGATGGAGACCCTCCTGTATG-5′，BIK-R：3′-AGGGTCCAGGTCCTCTTCAGA-5′；PUMAF：3′-GACCTCAACGCACAGTACGAG-5′，PUMA-R：3′-AGGAGTCCCATGATGAGATTGT-5′。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件處理，組間計(jì)量資料比較，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 槲皮素能夠增強(qiáng)吉西他濱對(duì)胰腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用 胰腺癌細(xì)胞Panc-1接種入96孔板，4組實(shí)驗(yàn)分別為槲皮素（終濃度為50μM）組，吉西他濱（50μg/ml）組和槲皮素+吉西他濱聯(lián)合組，同時(shí)還有空白對(duì)照組。加藥后繼續(xù)培養(yǎng)，分別在24、48、72和96h時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)細(xì)胞的存活情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞在空白對(duì)照組持續(xù)增殖，至72～96 h，增值速度減緩，而另外3個(gè)處理組，癌細(xì)胞增殖抑制、凋亡明顯。槲皮素和吉西他濱能夠誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡，而槲皮素能夠增強(qiáng)吉西他濱的抗胰腺癌的能力，與單獨(dú)吉西他濱組和槲皮素組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），同時(shí)聯(lián)合效果大于兩者單獨(dú)處理細(xì)胞的效果之和（見圖1）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明槲皮素能夠增強(qiáng)吉西他濱殺傷胰腺癌細(xì)胞的作用，且與吉西他濱單獨(dú)使用差異極其顯著。

2.2 吉西他濱聯(lián)合槲皮素比單獨(dú)使用更能促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡 胰腺癌細(xì)胞在槲皮素（終濃度為50μM）組，吉西他濱（50μg/ml）組和槲皮素+吉西他濱聯(lián)合處理后72h，收集細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。如圖2所示，空白對(duì)照組（圖2A）和槲皮素組（圖2B）凋亡率分別為18.49%和21.28%，差別不顯著。而吉西他濱和吉西他濱聯(lián)合槲皮素的處理，與對(duì)照組比較，能夠顯著誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡，凋亡率分別為38.4%和52.2%。吉西他濱聯(lián)合槲皮素后誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡的效果明顯高于吉西他濱單獨(dú)使用。

圖1 槲皮素、吉西他濱、槲皮素+吉西他濱聯(lián)合對(duì)Panc-1細(xì)胞處理后細(xì)胞存活檢測(cè)

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡情況

2.3 吉西他濱聯(lián)合槲皮素能夠減少S期胰腺癌細(xì)胞的比例 在吉西他濱聯(lián)合槲皮素能夠顯著誘導(dǎo)凋亡的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步做了細(xì)胞周期檢測(cè)，確定是否聯(lián)合用藥能夠改變胰腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期。如圖3所示，對(duì)照組（45%）和槲皮素組（41%）的S期細(xì)胞量明顯多于吉西他濱（36%）和聯(lián)合用藥（34%）。可見吉西他濱聯(lián)合槲皮素后較其他處理組更能減少S期胰腺癌細(xì)胞的比例。

2.4 聯(lián)合用藥可能通過(guò)BCL-2家族影響細(xì)胞凋亡在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，BCL-2家族充當(dāng)了重要角色。Bcl-2家族蛋白中有抑制凋亡的基因，如BCL-2、BCL-xl等；也有促進(jìn)凋亡基因BIK、BAX等[8]。為了檢測(cè)藥物在誘導(dǎo)Panc-1細(xì)胞凋亡過(guò)程，其分子機(jī)制是否通過(guò)BCL-2家族基因而導(dǎo)致，為了確定此問(wèn)題，我們用熒光定量PCR方法，檢測(cè)了4組（槲皮素組、吉西他濱組、槲皮素吉西他濱聯(lián)合組以及空白對(duì)照組）處理細(xì)胞中凋亡相關(guān)BCL-2家族部分成員的相對(duì)表達(dá)情況。如圖4所示，聯(lián)合用藥能夠顯著增強(qiáng)促凋亡基因（BAX和BIK）和減少抑制凋亡基因（BCL-1和BCL-xl）的表達(dá)。槲皮素增強(qiáng)吉西他濱對(duì)胰腺癌細(xì)胞Panc-1誘導(dǎo)凋亡的作用，可能是通過(guò)影響凋亡基因的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的[9]。

3 討論

胰腺癌是威脅國(guó)人健康的重要元兇之一，至今缺乏有效的治療手段，患者5年生存率極低[1-2]。吉西他濱是臨床上治療胰腺癌的首選藥物之一，但是其療效還未盡人意。槲皮素具有高效抗氧化、抗炎癥、降血壓、降血脂、改善動(dòng)脈病變和心律失常以及抗腫瘤等功效[10-11]。其抗腫瘤功能主要表現(xiàn)在能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期停滯，同時(shí)下調(diào)原癌基因（如Mcl-1、Ras、MEK和PI3K等）和上調(diào)腫瘤抑制基因（如p53和p21等）。在前列腺癌、宮頸癌、肺癌、乳腺癌和腸癌中，槲皮素都表現(xiàn)出了抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的能力[12]。

圖3 藥物對(duì)胰腺癌細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

圖4 藥物誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因BCL-2家族的表達(dá)情況

本研究利用吉西他濱聯(lián)合槲皮素共同誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞系Panc-1凋亡。通過(guò)細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示槲皮素能夠顯著增強(qiáng)吉西他濱誘導(dǎo)的殺傷能力，高于吉西他濱單獨(dú)使用。實(shí)驗(yàn)證實(shí)槲皮素增強(qiáng)吉西他濱殺傷能力可能是通過(guò)調(diào)節(jié)BCL-2家族相關(guān)基因的表達(dá)而影響的。

目前臨床上的化療藥物種類已經(jīng)很多，但是腫瘤的治療還未達(dá)到預(yù)期的效果，合理組合目前臨床上的藥物，是一條探索和開發(fā)更佳治療腫瘤方案的途徑之一[13-14]。本研究利用一種作為保健品的天然抗氧化劑聯(lián)合吉西他濱處理胰腺癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)此組合能夠顯著增強(qiáng)化療藥物的殺傷效果，這將為胰腺癌治療藥物吉西他濱與其他藥物聯(lián)合提供了參考借鑒。

[1]Siegel R,Naishadham D,Jemal A．Cancer statistics,2012[J]．CA Cancer J Clin,2012,62(1):10-29．

[2]Chrystoja C C,Diamandis E P,Brand R,et al．Pancreatic cancer [J]．Clin Chem,2013,59(1):41-46．

[3]Bardeesy N,DePinho R A．Pancreatic cancer biology and genetics[J]．Nat Rev Cancer,2002,2(12):897-909．

[4]Zhou B,Zhang J,Chen G,et al．Therapy of Smac mimetic SM-164 in combination with gemcitabine for pancreatic cancer[J]．Cancer Lett,2013,329(1):118-124．

[5]Ali S,Ahmad A,Banerjee S,et al．Gemcitabine sensitivity can be induced in pancreatic cancercellsthrough modulation of miR-200 and miR-21 expression by curcumin or its analogue CDF[J]．Cancer Res，2010,70(9):3606-3617．

[6]Wang P,Zhang K,Zhang Q,et al．Effects of quercetin on the apoptosis of the human gastric carcinoma cells[J]．Toxicol In Vitro,2012,26(2):221-228．

[7]Guillermet-Guibert J,Davenne L,Pchejetski D,et al．Targetingthe sphingolipid metabolism to defeat pancreatic cancer cell resistance to the chemotherapeutic gemcitabine drug[J]．Mol Cancer Ther,2009,8(4):809-820．

[8]Garcia-Saez A J．The secrets of the Bcl-2 family[J]．Cell Death Differ,2012,19(11):1733-1740．

[9]Thomas S,Quinn B A,Das S K,et al．Targeting the Bcl-2 family for cancer therapy[J]．Expert Opin Ther Targets,2013,17(1):61-75．

[10]Ranawat P,Pathak C M,Khanduja K L．A New Perspective on the Quercetin Paradox in Male Reproductive Dysfunction[D]．Phytother Res,2012．

[11]Dajas F．Life or death:neuroprotective and anticancer effects of quercetin[J]．J Ethnopharmacol,2012,143(2):383-396．

[12]Russo M,Spagnuolo C,Tedesco I,et al．The flavonoid quercetin in disease prevention and therapy:facts and fancies[J]．Biochem Pharmacol,2012,83(1):6-15．

[13] Sullivan K M,Kozuch P S．Chemotherapy and other supportive modalities in the palliative setting for pancreatic cancer[J]．Cancer J,2012,18(6):633-641．

[14] Smaglo B G,Pishvaian M J．Postresection chemotherapy for pancreatic cancer[J]．Cancer J,2012,18(6):614-623．

Quercetin enhances gemcitabine-induced apoptosis in pancreatic cancer cells panc-1

Quercetin Gemcitabine Pancreatic cancer cellProliferation Apoptosis

2012-12-28）

（本文編輯：田云鵬）

310009 杭州市第三人民醫(yī)院藥劑科（周小紅）；浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院藥劑科（徐飛龍、陳建）

【 Abstract】Objective To evaluate the effect of gemcitabine combined with quercetin on pancreatic cancer Panc-1 cells．Methods The cultured pancreatic cancer Panc-1 cells were divided into 4 groups:gemcitabine group (50μg/ml),quercetin group (50μM),gemcitabine+quercetin group and control group．Cell viability was assessed with MTT method on 24,48,72 and 96h after treatment．Cell apoptosis and cell cycle were examined by using flow cytometry．The expression of Bcl-2 genes was determined by quantitative real time PCR．Results The combination of gemcitabine and quercetin induced apoptosis of pancreatic cancer cells and blocked cell cycle and up-regulated the expression of apoptosis-related Bcl-2 gene family．Conclusion Gemcitabine combined with quercetin can significantly enhance the apoptosis of pancreatic cancer Panc-1 cells,which is associated with the up-regulated expression of Bcl-2 genes．