膿毒癥肺損傷治療中辣椒素對TLR4-NF-κB通路的影響

徐子琴 陳新國 徐建國 盧中秋 徐麗艷 南超

膿毒癥肺損傷治療中辣椒素對TLR4-NF-κB通路的影響

徐子琴 陳新國 徐建國 盧中秋 徐麗艷 南超

目的 探討辣椒素受體（TRPV1）激動劑辣椒素在膿毒癥肺損傷治療中對TOLL受體（TLR）4-核因子（NF）-κB通路的影響。方法選取ICR小鼠108只，按隨機數(shù)字表法分為6組：正常對照組（CON組）、辣椒素對照組（CAP+CON組)、TRPV1拮抗劑Capsazepine對照組（CAPZ+CON組）、膿毒癥組（LPS組）、辣椒素組（CAP組)、Capsazepine組（CAPZ組）。LPS組、CAP組、CAPZ組均腹腔注射脂多糖（LPS）10mg/kg以制備LPS肺損傷模型，對照組經(jīng)腹腔注射等量0．9%氯化鈉溶液。造模前0．5hCAP組、CAP+CON組小鼠預(yù)先腹腔注射辣椒素，而CAPZ組、CAPZ+CON組小鼠則注射Capsazepine。每組取注射后3、8、16h等各時點檢測肺組織NF-κB mRNA、TLR4 mRNA的表達(dá)量和肺組織含水量變化。結(jié)果與CON組比較，LPS組、CAP組、CAPZ組肺組織含水量在8、16h均有所上升（P＜0．05）；LPS組、CAP組、CAPZ組NF-κB mRNA、TLR4 mRNA在3、8、16h均表達(dá)增強 （均P＜0．05）；與LPS組比較，CAP組肺組織含水量在8、16h均下降，NF-κB mRNA在8、16h均表達(dá)減弱（均P＜0．05）。結(jié)論LPS肺損傷時TLR4 mRNA、NF-κB mRNA表達(dá)增強，肺組織含水量增加，辣椒素可能通過抑制NF-κB mRNA表達(dá)來減輕肺損傷，但對TLR4表達(dá)無影響。

膿毒癥 脂多糖 辣椒素 TOLL樣受體 核因子κB 肺損傷

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the protective effects of capsaicine on lung injury in septic mice and its mechanism．MethodsOne hundred and eight ICR male mice were randomly divided into six groups with 18 animals in each group．Septic model was induced by injection of lipopolysaccharide(LPS,10mg/kg)in LPS,CAP and CAPZ groups;0．5h before LPS administration normal saline,capsaicine and capsazepine(TRPV1 antagonist)were injected intraperitoneally respectively．For 3 control groups(CON,CAP+CON and CAPZ+CON groups),normal saline,capsaicine and capsazepine were injected i．p,respectively．The expressions of NF-κB mRNA and TLR4mRNA were detected by RT-PCR at 3,8 and 16h after injection and the histopathological changes and lung water contents were also observed．ResultsCompared to CON group,the lung tissue water content was increased in LPS,CAP and CAPZ groups at 8 and 16h after injection;the expressions of NF-κBmRNA and TLR4mRNA were increased in LPS,CAP and CAPZ groups at 3,8h and 16h(P＜0．05)．Compared to LPS group,the lung tissue water content and the expression of NF-κBmRNA were decreased in CAP group at 8h and 16h after injection(P＜0．05)．ConclusionCapsaicine attenuates lung injury of septic mice,which is associated with up-regulated expression of NF-κBmRNA,but not with TLR4mRNA．

膿毒癥是嚴(yán)重創(chuàng)（燒）傷、感染和外科大手術(shù)應(yīng)激后常見的并發(fā)癥，是導(dǎo)致臨床危重病患者死亡的重要原因之一。在膿毒癥發(fā)病過程中，肺臟的損傷發(fā)生較早，可發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征（ARDS），最終導(dǎo)致多臟器功能衰竭和死亡。LPS/TOLL受體（TLR）4-核因子（NF）-κB介導(dǎo)的失控性炎癥反應(yīng)是膿毒癥急性肺損傷發(fā)生的主要原因[1]，而膿毒癥中TLR4在含辣椒素受體（TRPV1）的三叉神經(jīng)元上有表達(dá)，并且TRPV1激動劑辣椒素能改善膿毒癥大鼠的低血壓，降低其病死率[2-5]。筆者通過構(gòu)建膿毒癥肺損傷模型，采用辣椒素激活或拮抗劑阻斷TRRV1，觀測TLR4 mRNA、NF-κB mRNA表達(dá)的變化，以及肺組織的病理改變、肺組織含水量的變化等，進(jìn)一步探討TRPV1激動劑辣椒素在膿毒癥肺損傷治療中對TLR4-NF-κB通路的影響機制。

1 材料和方法

1.1 材料 選取ICR雄性小鼠108只（溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供），體重18～22g，按隨機數(shù)字表法分成6組：正常對照組（CON組）、辣椒素對照組（CAP+ CON組)、TRPV1拮抗劑Capsazepine對照組（CAPZ+ CON組）、膿毒癥組（LPS組）、辣椒素組（CAP組)、Capsazepine組（CAPZ組），每組18只。

1.2 試劑和儀器 脂多糖（LPS）、辣椒素、Capsazepine均購自美國Sigma公司。Trizol reagment購自美國Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄-PCR（RT-PCR）試劑盒購自日本Thermo Scientific公司；Tap PCR master mix試劑盒購自北京天根生化科技公司，PCR引物均由上?；瞪锕こ坦驹O(shè)計合成，詳見表1。梯度PCR儀購自美國BioRAD公司，臺式超速冷凍離心機購自美國Beckman公司，凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國BioRAD公司，水平電泳儀購自北京六一電泳廠。

表1 RT-PCR引物序列

1.3 方法

1.3.1 模型建立 LPS組、CAP組、CAPZ組采用腹腔注射LPS 10mg/kg復(fù)制膿毒癥肺損傷模型；CON組、CAP+ CON組、CAPZ+CON組經(jīng)腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液。CAP+CON組、CAP組在建模前0.5h腹腔注射辣椒素1mg/kg；CAPZ+CON組、CAPZ組在建模前0.5h腹腔注射Capsazepine15mg/kg。

1.3.2 肺組織處理 每組分別在制模后3、8、16 h各取6只小鼠，腹腔注射4%水合氯醛6～10ml/kg麻醉，開胸取左肺吸干表面液體，稱濕重，然后放入80℃烤箱烘至恒重，稱干重；計算肺組織含水量：肺含水量=（濕重-干重）/濕重×100%。處死小鼠，即刻取右肺下葉，10%甲醛固定，石蠟包埋，每例切片3張，HE染色，光鏡下觀察肺組織病理變化；其余肺組織液氮保存待用。

1.3.3 RT-PCR檢測小鼠肺組織 NF-κB mRNA和TLR4 mRNA Trizol試劑提取小鼠肺組織細(xì)胞總RNA，檢測濃度及純度，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，按PCR擴增試劑盒說明書進(jìn)行進(jìn)行擴增，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3min→變性（94℃，30s）→退火30s（NF-κB：57.3℃，TLR4：63℃）→延伸（72℃，1min）→熱循環(huán)35次→72℃，5min→4℃，1h。采用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)掃描圖像，并用Quantity one進(jìn)行灰度值分析，得出NF-κB mRNA和TLR4 mRNA基因表達(dá)相對量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組肺組織含水量的變化 見表2。

表2 各組肺組織含水量的變化（%）

由表2可見，與CON組比較，CAP+CON組、CAPZ+ CON組肺組織含水量在3、8、16h的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05)；LPS組、CAP組、CAPZ組肺組織含水量在8、16h各點均有上升，與CON組的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。與LPS組比較，CAP組肺組織含水量在8、16h均下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），CAPZ組在3、8、16h各點與LPS組的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05)。

2.2 各組光鏡觀察結(jié)果 CON組、CAP+CON組、CAPZ+CON組3組肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡間隔無水腫、炎癥，肺泡腔清晰；LPS組8、16h時可見肺泡大小不等，部分肺泡壁斷裂呈氣腫狀，部分肺泡萎陷，肺泡壁增寬，肺泡毛細(xì)血管擴張，肺間質(zhì)見多行核炎癥細(xì)胞浸潤；CAP組較LPS組滲出明顯減輕；CAPZ組與LPS組相比無明顯加重。

2.3 各組肺組織NF-κB mRNA表達(dá)的比較 見表3。

由表3可見，與CON組比較，CAP+CON組、CAPZ+ CON組肺組織NF-κB mRNA在3、8、16h各點的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05)，LPS組、CAP組、CAPZ組NF-κB mRNA在3、8、16h各點均表達(dá)增強，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。與LPS組比較，CAP組在8、16h表達(dá)減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而CAPZ組在3、8、16h各點的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

表3 各組肺組織NF-κB mRNA表達(dá)的比較

2.4 各組肺組織TLR4 mRNA的表達(dá)變化 見表4。

表4 各組肺組織TLR4 mRNA的表達(dá)

由表4可見，與CON組比較，CAP+CON組、CAPZ+CON組肺組織TLR4 mRNA在3、8、16h各點的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），LPS組、CAP組、CAPZ組肺組織TLR4 mRNA在3、8、16h均表達(dá)增強，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。與LPS組比較，CAP組、CAPZ組在3、8、16h各點的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

3 討論

在膿毒癥致病過程中，肺部損傷發(fā)生較早也最為突出，是導(dǎo)致膿毒癥死亡的重要原因。目前認(rèn)為膿毒癥肺損傷發(fā)生與炎癥介質(zhì)的過度釋放密切相關(guān)，而TLR4-NF-κB信號通路是導(dǎo)致肺部炎癥性損傷的核心環(huán)節(jié)。LPS與TLR 4和黏附分子（CD）14結(jié)合后可激活NF-κB，介導(dǎo)包括腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細(xì)胞介素（IL）-6等眾多炎癥因子的基因表達(dá)，這些過度釋放的炎癥因子反過來又可以進(jìn)一步激活NF-κB，從而形成正反饋的級聯(lián)放大效應(yīng)，產(chǎn)生過度的炎癥反應(yīng)，引起肺臟組織和細(xì)胞損害的發(fā)生[5]。

TRPV1是一種配體門控的非選擇性陽離子通道，主要定位于分泌P物質(zhì)和降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）的感覺神經(jīng)纖維C和Aδ[6]。辣椒素是TRPV1常見的激動劑，是一種香草酰胺衍生物，化學(xué)結(jié)構(gòu)為8-甲基-N-香草基-6-壬烯基酰胺（C18H27NO3），呈單斜長方形片狀無色結(jié)晶，辣椒素在體外對細(xì)菌有很好的抑菌活性，不僅對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌有明顯的抑菌效果，對大腸桿菌、酵母菌、霉菌等也有一定的抑菌效果[7]，更有動物實驗發(fā)現(xiàn)辣椒素不僅能改善內(nèi)皮細(xì)胞功能，減輕LPS細(xì)胞凋亡，還能改善膿毒癥大鼠的低血壓，降低其病死率，減輕肺損傷的氧化應(yīng)激反應(yīng)。膿毒癥患者和細(xì)菌性腦膜炎患者動脈血中CGRP升高[8]，也有研究發(fā)現(xiàn)TLR4與TRPV1在感覺神經(jīng)上共定位的現(xiàn)象[4，9]，因此TRPV1與LPS/TLR4-NF-κB信號通路相關(guān)的病理生理學(xué)過程可能存在某種聯(lián)系。

本研究中CON組、CAP+CON組、CAPZ+CON組3組的TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、肺病理變化、肺組織含水量等方面的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），提示TRPV1激動作用可能僅在膿毒癥肺損傷時對肺組織過度表達(dá)的TLR4-NF-κB通路有影響，從而遏制過度炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生，而在非膿毒癥狀態(tài)時并無此作用。與CON組比較，LPS組TLR4 mRNA、NF-κB mRNA表達(dá)增強，這與其他學(xué)者的研究相符合[5]；CAP組和CAPZ組TLR4 mRNA、NF-κB mRNA也較CON組增強，提示辣椒素只能減輕肺損傷，而影響膿毒癥引起的肺組織TLR4-NF-κB通路的因素可能為多方面，激活TRPV1受體只是其中之一。與LPS組比較，激動TRPV1受體的CAP組NF-κB mRNA表達(dá)均較LPS組減弱，提示辣椒素有保護效應(yīng)，而肺組織光鏡的病理改變也較LPS組減輕，肺組織含水量減少，也說明其對膿毒癥引起的肺損傷有一定保護作用；但TLR4 mRNA表達(dá)無明顯變化，拮抗TRPV1的CAPZ組也并未看到TLR4 mRNA表達(dá)明顯增強，結(jié)合膿毒癥可通過TLR4表達(dá)的增加來激活三叉神經(jīng)元上的TRPV1[4]，提示TRPV1激動對TLR4-NF-κB通路的影響效力僅在NF-κB，TRPV1可能在TLR4的下游，對TLR4無逆向干預(yù)之力。因此，膿毒癥肺損傷時TLR4 mRNA、NF-κB mRNA表達(dá)增強，TRPV1激動可通過抑制NF-κB mRNA表達(dá)來減輕肺損傷，但對TLR4 mRNA表達(dá)無影響。

綜上所述，本實驗通過辣椒素激活或拮抗劑阻斷TRPV1，從正反兩方面論證辣椒素在膿毒癥肺損傷治療中的潛在價值；同時，通過檢測TLR4 mRNA和NF-κB mRNA的表達(dá)和活性改變及肺組織含水量的變化，探討TRPV1受體在膿毒癥肺損傷治療中的作用機制，不僅深化了TRPV1與炎癥反應(yīng)關(guān)系的認(rèn)識，同時也為膿毒癥治療提供了新的靶標(biāo)和理論依據(jù)。

[1] 陳曉彤,王壽平,鄒子俊,等．Toll樣受體4單克隆抗體預(yù)處理對脂多糖誘發(fā)小鼠急性肺損傷的影響[J]．中華急診醫(yī)學(xué)雜志,2011,20(10): 1052-1055．

[2]Wang Y,Novotny M,Quaiserová-Mocko V,et al．TRPV1-mediated protection against endotoxin induced hypotension and mortality in rats[J]．Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2008, 294(5):1517-1523．

[3]Chularojmontri L,Suwatronnakorn M,Wattanapitayakul S K．Influence of capsicum extract and capsaicin on endothelial health[J]．J Med Assoc Thai,2010,93:S92-101．

[4]Abdel-Salam O M,Abdel-Rahman R F,Sleem A A,et al．Modulation of lipopolysaccharide-induced oxidative stress by capsaicin[J]．Inflammopharmacology,2012,20(4):207-217．

[5] Diogenes A,Ferraz C C,Akopian A N,et al．LPS sensitizes TRPV1 via activation of TLR4 in trigeminal sensory neurons[J]．J Dent Res, 2011,90(6):759-764．

[6] Khadija Alawi,Julie Keeble．The paradoxical role of the transient receptor potential vanilloid 1 receptor in inflammation[J]．Pharmacol Ther,2010,125(2):181-195．

[7]張繼紅,陶能國,李俊麗,等．辣椒素的提取及抑菌活性研究[J]．廣西植物,2010,30(1):137-140．

[8] Berg R M,Strauss G I,Tofteng F,et al．Circulating levels of vasoactive peptides in patients with acute bacterial meningitis[J]．Intensive Care Med,2009,35(9):1604-1608．

[9] Zakir H M,Mostafeezur R M,Suzuki A,et al．Expression of TRPV1 channels after nerve injury provides an essential delivery tool for neuropathic pain attenuation[J]．PLoS One,2012,7(9):e 44023．

Protective effects of capsaicine on lung injury in septic mice and its mechanism

Sepsis Lipopolysaccharide Capsaicine TOLL receptorNuclear factor of kappa B Lung injury

2013-03-28）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

溫州市科技局課題（Y20100302）

325000 溫州市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科（徐子琴、徐建國），急診科（陳新國）；溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科（盧中秋、徐麗艷、南超）

徐子琴，E-mail:xuziqin1980206@sina.com