• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    Hsa_circ_0008957靶MiRNA預(yù)測(cè)及其表達(dá)載體構(gòu)建

    2022-01-08 06:54:22李仙仙魯艷芹韓金祥
    罕少疾病雜志 2022年1期
    關(guān)鍵詞:質(zhì)粒測(cè)序載體

    李仙仙 魯艷芹,2,* 韓金祥,2,*

    1.山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)生物醫(yī)學(xué)科學(xué)學(xué)院 (山東 濟(jì)南 250014)

    2.山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科 (山東 濟(jì)南 250062)

    CircRNA即環(huán)狀RNA分子,是通過(guò)共價(jià)鍵連接的環(huán)形構(gòu)造的不具有5’末端磷酸基和3’末端poly(A)羥基的非編碼RNA分子[1]。根據(jù)形成方式不同,circRNAs可分為內(nèi)含子circRNAs、外顯子circRNAs和內(nèi)含子-外顯子circRNAs(ElciRNA),大多數(shù)的circRNAs來(lái)自蛋白質(zhì)編碼基因的外顯子[2]。作為環(huán)狀RNA,可以有效地防止被RNA酶和核酸外切酶降解掉,比線性RNA的穩(wěn)定性要強(qiáng)。它會(huì)在血漿和外泌體中穩(wěn)定并廣泛存在,所以circRNAs常作為疾病的生物標(biāo)記物。CircRNA在不同物種間在進(jìn)化上具有高度保守性[3];在動(dòng)物不同時(shí)期、不同組織的表達(dá)水平不同,具有表達(dá)的時(shí)序性與特異性。

    circRNA分子能與miRNA中的應(yīng)答元件(miRNA response element,MRE)結(jié)合,作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(competing endogenousRNA,ceRNA)與miRNA結(jié)合,中起到miRNA海綿的作用,進(jìn)而降除miRNA對(duì)其目標(biāo)基因的抑制作用,提高目標(biāo)基因的表達(dá)水平[4]。

    CircRNAs可以調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄,ElciRNA可以與RNA聚合酶結(jié)合,影響其轉(zhuǎn)錄活性[5]。如果circRNAs序列中含有其母本基因的起始密碼子,可能會(huì)影響其轉(zhuǎn)錄本的翻譯,可編碼蛋白[6]。近年來(lái),circRNAs在腫瘤疾病[7]、心腦血管疾病[8-9]、神經(jīng)系統(tǒng)疾病[10]以及骨相關(guān)疾病[11]等諸多病理狀態(tài)時(shí)表達(dá)異常,并且其表達(dá)水平與疾病的發(fā)生階段有緊密聯(lián)系[12],可作為評(píng)估病情的潛在指標(biāo)。

    COL1A2是Ⅰ型膠原蛋白的結(jié)構(gòu)基因之一,Ⅰ型膠原蛋白是動(dòng)物體內(nèi)分布最廣、含量最豐富的的蛋白質(zhì),起到支撐、保護(hù)機(jī)體的功能,其主要分布在真皮、肌腱、骨和牙本質(zhì)等[13]。另外它還在腫瘤間質(zhì)成纖維細(xì)胞[14]及血管細(xì)胞[15]中表達(dá)。COL1A2基因多個(gè)獨(dú)立突變會(huì)引起骨骼和心血管缺陷,如成骨不全和Ehlers-Danlos綜合征[16]。但它的突變與腫瘤的發(fā)生機(jī)理仍不清楚,只是在某些腫瘤細(xì)胞中COL1A2表達(dá)上調(diào)或者下調(diào),如結(jié)直腸癌,肝癌[17],且COL1A2被鑒定為與轉(zhuǎn)移潛力高度相關(guān)的17個(gè)基因之一[18],COL1A2基因在某些轉(zhuǎn)移性腫瘤中上調(diào)。

    Circ RNAs 作為當(dāng)下的研究熱點(diǎn),本研究通過(guò)對(duì)COL1A2基因circRNA進(jìn)行預(yù)測(cè),對(duì)hsa-col1a2-circ-0008957基因進(jìn)行克隆,構(gòu)建表達(dá)載體,該circRNA尚未報(bào)道,研究意義較大,可為后續(xù)細(xì)胞水平機(jī)制方面的研究奠定基礎(chǔ)。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自O(shè)MEGA_bio_tek有限公司;PCR試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq酶、內(nèi)切酶(KpnI和BamHI)購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;Clon ExpressⅡ One Step Cloning Kit試劑購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;Yeast Extract和TRYPTone均購(gòu)自O(shè)XOID公司;氯化鈉試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;Agar Powder購(gòu)自索萊寶科技有限公司;大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、pCD 2.1質(zhì)粒均由山東省罕少見(jiàn)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

    1.2 方法

    1.2.1 Hsa_COL1A2_circ_0008957序列的獲取及引物的設(shè)計(jì)及合成。采用circbase網(wǎng)站,查詢以COL1A2為母本基因的circRNA,挑選出hsa_col1a2_circ_0008957,并獲得其基因序列,利用載體的酶切位點(diǎn)通過(guò)軟件CE Design V1.04設(shè)計(jì)基因特異性擴(kuò)增引物,用于目的基因的PCR擴(kuò)增,引物序列如下表1(黑體序列為同源臂,小寫序列為酶切位點(diǎn),下劃線序列為正/反向環(huán)化介導(dǎo)序列),引物均由華大基因有限公司合成。

    表1 引物序列

    1.2.2 RNA提取及cDNA合成 采用Trizol法提取293T細(xì)胞總RNA,檢測(cè)核酸濃度及純度,選取合格的RNA用于cDNA合成。第一步去除基因組DNA;Random Primer(6mer)1μL,dNTP Mix(10nm)1μL,模板RNA 2μg,RNase-free ddH2O補(bǔ)足10μL,65℃5min,4℃ 2min;第二步逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):在第一步反應(yīng)產(chǎn)物中加入5xPrimer Script Buffer 4μL,RNase Inhibitor0.5μL,Primer Script Reverse Transcriptase 1μL,RNase-free ddH2O 4.5μL,按下列反應(yīng)程序合成第一條鏈cDNA:30℃10min;42℃60min;70℃15min[19]。產(chǎn)物置于-80℃保存。

    1.2.3 PCR擴(kuò)增Hsa_COL1A2_circ_0008957 以cDNA為模板PCR 擴(kuò)增Hsa_COL1A2_circ_0008957,PCR 反應(yīng)體系20 μL:2xGCBuffer 10 μL,dNTP Mixture(2.5nm)1.6μL,TaKaRa Taq 0.1μL,模板cDNA(1000ng),上下游引物各1μL,RNase-free ddH2O補(bǔ)足20μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min;95℃變性15s,50℃退火20s,72℃延伸30s,共35個(gè)循環(huán)。72℃延伸5min,4℃結(jié)束反應(yīng)。

    1.2.4 pCD2.1-hCOL1A2-circ-0008957重組載體構(gòu)建及檢測(cè) PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分離,將目的DNA片段進(jìn)行切膠回收純化。pCD2.1載體用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切,37℃酶切4h,電泳并回收酶切產(chǎn)物,與目的片段進(jìn)行同源重組。將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,在含氨芐青霉素(Amp+)的LB固體培養(yǎng)基上涂布,置于37℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)12~16h。挑取單菌落克隆,在含氨芐青霉素(Amp+)的LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng),并將菌液進(jìn)行菌液PCR鑒定,挑取鑒定正確的的單克隆菌液利用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒,并最終進(jìn)一步酶切驗(yàn)證,將鑒定正確的質(zhì)粒送去華大基因進(jìn)行Sanger測(cè)序,將測(cè)序正確的質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),并用75%甘油保存在-80℃冰箱。

    1.2.5 Hsa-COL1A2-circ-0008957生物信息學(xué)預(yù)測(cè) 應(yīng)用circBANK(http://www.circbank.cn/)軟件和Circular RNA Interactome 軟件(https://circinteractome.nia.nih.gov/)對(duì)hsa-COL1A2-circ-0008957進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

    2 結(jié)果

    2.1 pCD2.1-hCOL1A2-circ0008957重組載體的驗(yàn)證用限制性內(nèi)切酶將pCD2.1原載體雙酶切后,獲得100bp左右的片段,與預(yù)期相符(圖1A);PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示,擴(kuò)增條帶大小約372bp,與預(yù)期相符(圖1B);將純化的目的基因與線性載體pCD2.1進(jìn)行連接后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定,出現(xiàn)了與預(yù)期相符的目的條帶,大小為372bp(圖1C);提取質(zhì)粒后對(duì)其進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證,重組片段也出現(xiàn)了372bp的目的條帶(圖1D)。

    圖1 pCD2.1-hCOL1A2-circ0008957重組載體的驗(yàn)證

    2.2 重組載體pCD2.1-hCOL1A2-circ0008957 Sanger測(cè) 將陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)分析,與預(yù)期結(jié)果完全一致,表明成功構(gòu)建pCD2.1-hCOL1A2-circ0008957重組載體(圖2)。

    圖2 pCD2.1-hCOL1A2-circ0008957 Sanger測(cè)序結(jié)果

    2.3 Hsa-COL1A2-circ0008957生物信息學(xué)預(yù)測(cè)應(yīng)用軟件分析,其在circBANK中的ID為hsa_circCOL1A2_116,開放閱讀框長(zhǎng)度(ORF-SIZE)為171bp;存在IRES(internal ribosome entry site)序列,可通過(guò)此啟動(dòng)翻譯行使編碼蛋白的功能,這與其他普通線性RNA是不同的;網(wǎng)站中提供的coding_prob卻為0.0019(范圍為0-1),分?jǐn)?shù)較低,表明其編碼潛力較低,其功能還待進(jìn)一步研究,在網(wǎng)站中檢索到該circRNA位于其母本基因COL1A2的mRNA的外顯子中,且被發(fā)現(xiàn)存在于成骨細(xì)胞、皮下前脂肪細(xì)胞、膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞中。Circular RNA Interactome 軟件預(yù)測(cè)到hCOL1A2-circ-0008957相互結(jié)合的miRNA有17種,其中與成骨分化和骨質(zhì)疏松相關(guān)的miRNA有5種,該circRNA與5種miRNA的結(jié)合位點(diǎn)如圖3。

    圖3 circRNA與靶向MiRNA的結(jié)合位點(diǎn)

    3 討論

    CircRNA較其他線性RNA研究開始較晚,隨著circRNA研究的深入開展,越來(lái)越多的circRNA被發(fā)現(xiàn)。CircRNA多在腫瘤中報(bào)道,有少量關(guān)于骨相關(guān)疾病的報(bào)道。本研究中,hsa-COL1A2-circ-0008957在之前從未報(bào)道,該circRNA無(wú)編碼蛋白的功能,猜測(cè)它靶向miRNA分子海綿進(jìn)而調(diào)節(jié)成骨分化。通過(guò)circinteractome數(shù)據(jù)庫(kù)得出17種靶向miRNA分析,其中hsa-miR-1305、hsa-miR-140-3p、hsa-miR-421、hsa-miR-548c-3p和hsa-miR-628-3p五種miRNA與骨質(zhì)疏松,成骨分化相關(guān);hsa-miR-618、hsa-miR-561、hsa-miR-1233、hsa-miR-1305、hsamiR-558、hsa-miR-577、hsa-miR-518a-5p、hsamiR-527、hsa-miR-1200和hsa-miR-1183與腫瘤疾病相關(guān);hsa-miR-561可作為腫瘤的生物靶標(biāo),hsa-miR-1200也可作為妊娠糖尿病的靶標(biāo);hsa-miR-1225-3p、hsamiR-1183和hsa-miR-197與自身免疫系統(tǒng)疾病相關(guān)。COL1A2作為該circRNA的母本基因,它與骨骼發(fā)育有關(guān),為后續(xù)研究其在成骨分化中的作用奠定基礎(chǔ)。

    猜你喜歡
    質(zhì)粒測(cè)序載體
    創(chuàng)新舉措強(qiáng)載體 為僑服務(wù)加速跑
    杰 Sir 帶你認(rèn)識(shí)宏基因二代測(cè)序(mNGS)
    新民周刊(2022年27期)2022-08-01 07:04:49
    二代測(cè)序協(xié)助診斷AIDS合并馬爾尼菲籃狀菌腦膜炎1例
    傳染病信息(2021年6期)2021-02-12 01:52:58
    堅(jiān)持以活動(dòng)為載體有效拓展港澳臺(tái)海外統(tǒng)戰(zhàn)工作
    短乳桿菌天然質(zhì)粒分類
    TiO_2包覆Al_2O_3載體的制備及表征
    重組質(zhì)粒rAd-EGF構(gòu)建并轉(zhuǎn)染hDPSCs對(duì)其增殖的影響
    Survivin-siRNA重組質(zhì)粒對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y的作用
    基因捕獲測(cè)序診斷血癌
    單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)研究進(jìn)展
    波多野结衣巨乳人妻| 亚洲国产精品成人久久小说 | a级毛片a级免费在线| 精品久久久久久久久亚洲| 全区人妻精品视频| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产高清三级在线| 少妇人妻精品综合一区二区 | 欧美一区二区亚洲| 黄片无遮挡物在线观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 99久久成人亚洲精品观看| 一级av片app| 国产单亲对白刺激| 在现免费观看毛片| 久久精品综合一区二区三区| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲欧美日韩无卡精品| 中文字幕av成人在线电影| 看免费成人av毛片| 国产精品久久久久久久久免| 1024手机看黄色片| 欧美zozozo另类| 欧美精品国产亚洲| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 国内精品美女久久久久久| 插逼视频在线观看| 亚洲最大成人中文| 午夜视频国产福利| 亚洲国产精品国产精品| 免费看av在线观看网站| 国产精品一区www在线观看| 日本av手机在线免费观看| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 国产一级毛片七仙女欲春2| 尾随美女入室| 亚洲无线观看免费| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 午夜视频国产福利| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 亚洲人成网站在线播| 国产成人影院久久av| 国产精品女同一区二区软件| 成人亚洲精品av一区二区| 国产一区二区在线av高清观看| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产成人精品久久久久久| 亚洲中文字幕日韩| 岛国毛片在线播放| 婷婷亚洲欧美| 婷婷亚洲欧美| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 男人和女人高潮做爰伦理| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 成人午夜精彩视频在线观看| 日本av手机在线免费观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲天堂国产精品一区在线| 欧美激情在线99| 国产亚洲5aaaaa淫片| 赤兔流量卡办理| videossex国产| 亚洲欧美精品专区久久| 欧美高清成人免费视频www| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 欧美+亚洲+日韩+国产| 午夜精品国产一区二区电影 | 网址你懂的国产日韩在线| 看片在线看免费视频| 天堂影院成人在线观看| 成人二区视频| 在线免费观看不下载黄p国产| 午夜福利在线观看吧| 狠狠狠狠99中文字幕| 欧美性猛交黑人性爽| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲精品成人久久久久久| 精品一区二区三区人妻视频| 亚洲经典国产精华液单| 亚洲人成网站在线观看播放| 国产av一区在线观看免费| 99热这里只有是精品在线观看| 亚洲成人久久爱视频| 国产成人影院久久av| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 美女黄网站色视频| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 中文亚洲av片在线观看爽| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 亚洲在线观看片| 校园春色视频在线观看| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 一本久久精品| 日日干狠狠操夜夜爽| 岛国在线免费视频观看| 我要搜黄色片| 亚洲精品色激情综合| eeuss影院久久| 国产极品天堂在线| 国产高潮美女av| 久久久久久久久久久免费av| 久久亚洲国产成人精品v| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 欧美高清性xxxxhd video| 成年av动漫网址| 女人被狂操c到高潮| 如何舔出高潮| 中文字幕免费在线视频6| 内地一区二区视频在线| 亚洲人成网站在线播| 成年av动漫网址| 日本一本二区三区精品| 成人欧美大片| 深夜精品福利| av在线观看视频网站免费| 日韩一本色道免费dvd| 日韩欧美 国产精品| 亚洲欧美精品自产自拍| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 精品人妻偷拍中文字幕| 久久精品人妻少妇| 在线观看av片永久免费下载| 国产精品综合久久久久久久免费| 免费观看在线日韩| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 我的老师免费观看完整版| 91久久精品电影网| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产三级在线视频| 亚洲精品自拍成人| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产黄片美女视频| 看片在线看免费视频| 日韩在线高清观看一区二区三区| 欧美变态另类bdsm刘玥| 欧美最黄视频在线播放免费| 欧美变态另类bdsm刘玥| 在线观看66精品国产| 欧美三级亚洲精品| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲成a人片在线一区二区| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 久久午夜福利片| 亚洲精品久久国产高清桃花| 久久国内精品自在自线图片| 久久久国产成人免费| 国产单亲对白刺激| 国产综合懂色| 99热这里只有是精品50| 男女那种视频在线观看| 亚洲第一电影网av| 国产v大片淫在线免费观看| 国产精品蜜桃在线观看 | 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产综合懂色| 国产色婷婷99| 91精品一卡2卡3卡4卡| 少妇高潮的动态图| 国产精品乱码一区二三区的特点| 免费看光身美女| 久久精品91蜜桃| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲av中文av极速乱| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 此物有八面人人有两片| 亚洲av中文av极速乱| 国产av在哪里看| 只有这里有精品99| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 久久中文看片网| 观看美女的网站| 给我免费播放毛片高清在线观看| 精品无人区乱码1区二区| 一边摸一边抽搐一进一小说| 在线观看午夜福利视频| 春色校园在线视频观看| 亚洲欧美日韩高清专用| 1024手机看黄色片| 一进一出抽搐动态| a级毛色黄片| 十八禁国产超污无遮挡网站| 黄色欧美视频在线观看| 中文资源天堂在线| 在线观看免费视频日本深夜| 久久久午夜欧美精品| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 丰满乱子伦码专区| 国产视频首页在线观看| 免费电影在线观看免费观看| eeuss影院久久| av天堂在线播放| 深夜精品福利| 嫩草影院新地址| 欧美在线一区亚洲| 亚洲无线在线观看| 一个人免费在线观看电影| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 国产精品久久久久久精品电影小说 | 成人亚洲精品av一区二区| 老司机福利观看| 国产伦精品一区二区三区四那| 欧美日韩国产亚洲二区| 久久久久久久久久久免费av| 成年女人看的毛片在线观看| 久久热精品热| 久久久成人免费电影| 国产精品精品国产色婷婷| 日日干狠狠操夜夜爽| 亚洲va在线va天堂va国产| 好男人在线观看高清免费视频| 在现免费观看毛片| 人妻少妇偷人精品九色| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 一区二区三区免费毛片| 精品久久久久久成人av| 日韩一区二区视频免费看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 在线观看免费视频日本深夜| 村上凉子中文字幕在线| 久久中文看片网| 好男人视频免费观看在线| 能在线免费观看的黄片| 久久久久久久久久久丰满| 欧美最黄视频在线播放免费| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 午夜福利高清视频| 美女黄网站色视频| 69人妻影院| 少妇人妻精品综合一区二区 | 看十八女毛片水多多多| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 免费观看人在逋| 桃色一区二区三区在线观看| 亚洲在线自拍视频| 国产白丝娇喘喷水9色精品| av天堂在线播放| 一级毛片电影观看 | 国产男人的电影天堂91| 天天躁日日操中文字幕| 一级av片app| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产精品久久久久久av不卡| 欧美成人一区二区免费高清观看| av女优亚洲男人天堂| 色视频www国产| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 欧美日韩国产亚洲二区| 看免费成人av毛片| 亚洲av二区三区四区| 亚洲精品亚洲一区二区| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 精品久久久久久久久av| 六月丁香七月| 好男人在线观看高清免费视频| 亚洲最大成人手机在线| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国产在线精品亚洲第一网站| 日韩视频在线欧美| 国产av麻豆久久久久久久| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲经典国产精华液单| 2022亚洲国产成人精品| 欧美日韩精品成人综合77777| 亚洲国产欧美人成| 国产成人a∨麻豆精品| 国产真实乱freesex| 亚洲国产精品久久男人天堂| 成人午夜精彩视频在线观看| 99久久九九国产精品国产免费| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲精品自拍成人| 国产精品一及| 国产精品精品国产色婷婷| 最后的刺客免费高清国语| 99热6这里只有精品| 别揉我奶头 嗯啊视频| 欧美变态另类bdsm刘玥| 看十八女毛片水多多多| 久久久久久九九精品二区国产| 看非洲黑人一级黄片| 变态另类丝袜制服| 色播亚洲综合网| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 成人亚洲精品av一区二区| 美女被艹到高潮喷水动态| 国产探花极品一区二区| av在线蜜桃| 国产一区二区在线观看日韩| 九九热线精品视视频播放| 国产成人a∨麻豆精品| 久久精品国产亚洲网站| 国产精品永久免费网站| 国产成人一区二区在线| 夫妻性生交免费视频一级片| 亚洲av.av天堂| 91久久精品国产一区二区成人| 一级毛片我不卡| 国产精品久久久久久久久免| 婷婷精品国产亚洲av| 国产精品,欧美在线| 国产精品精品国产色婷婷| 嫩草影院精品99| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产精品蜜桃在线观看 | 热99re8久久精品国产| 免费在线观看成人毛片| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 国产69精品久久久久777片| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 特级一级黄色大片| 男女啪啪激烈高潮av片| 国产伦精品一区二区三区视频9| 国产一区二区激情短视频| 好男人视频免费观看在线| 精品人妻熟女av久视频| 久久精品国产亚洲av天美| 99精品在免费线老司机午夜| 日本黄大片高清| 久久这里只有精品中国| 日日干狠狠操夜夜爽| 精品日产1卡2卡| 国内精品一区二区在线观看| 午夜福利高清视频| 又粗又硬又长又爽又黄的视频 | 丝袜美腿在线中文| 国产单亲对白刺激| 天堂网av新在线| 精品不卡国产一区二区三区| 国产精品福利在线免费观看| 久久精品影院6| 最近手机中文字幕大全| 又爽又黄a免费视频| 网址你懂的国产日韩在线| 国产精品av视频在线免费观看| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 久久精品国产亚洲网站| 久久久久久久亚洲中文字幕| 尾随美女入室| 日韩一本色道免费dvd| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产视频首页在线观看| 一本久久中文字幕| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 欧美最新免费一区二区三区| 搡女人真爽免费视频火全软件| 最近中文字幕高清免费大全6| 干丝袜人妻中文字幕| 18+在线观看网站| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 亚洲欧美精品自产自拍| 午夜a级毛片| 日韩欧美国产在线观看| 麻豆一二三区av精品| 天堂中文最新版在线下载 | 中文字幕av成人在线电影| 国产熟女欧美一区二区| 日本黄色视频三级网站网址| 亚洲成人av在线免费| 成人毛片a级毛片在线播放| 欧美又色又爽又黄视频| 99在线人妻在线中文字幕| 99久久精品国产国产毛片| 欧美色欧美亚洲另类二区| 精品久久久久久久久久久久久| 大香蕉久久网| 22中文网久久字幕| 亚洲精品日韩av片在线观看| 色综合亚洲欧美另类图片| 久久久久久国产a免费观看| 日本免费a在线| a级毛片a级免费在线| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 嫩草影院新地址| 国产淫片久久久久久久久| 人人妻人人看人人澡| 成人三级黄色视频| 国产精品久久视频播放| 最近最新中文字幕大全电影3| 男的添女的下面高潮视频| 黄色视频,在线免费观看| 欧美极品一区二区三区四区| 欧美区成人在线视频| 99在线人妻在线中文字幕| 日韩一区二区三区影片| 欧美激情久久久久久爽电影| 亚洲av.av天堂| 好男人在线观看高清免费视频| 亚洲人成网站在线观看播放| 日本色播在线视频| 日本一二三区视频观看| 免费一级毛片在线播放高清视频| 久久99精品国语久久久| 美女内射精品一级片tv| 国产色婷婷99| 国产亚洲5aaaaa淫片| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 青春草视频在线免费观看| 两个人的视频大全免费| 乱人视频在线观看| 亚洲美女搞黄在线观看| 身体一侧抽搐| av在线天堂中文字幕| 国产av一区在线观看免费| 此物有八面人人有两片| 午夜福利在线观看吧| 成人美女网站在线观看视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲五月天丁香| 成人综合一区亚洲| 黄片无遮挡物在线观看| 午夜福利在线观看吧| 国产精品野战在线观看| 国产精品福利在线免费观看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 欧美潮喷喷水| 精华霜和精华液先用哪个| 插阴视频在线观看视频| 亚洲人成网站在线观看播放| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 99riav亚洲国产免费| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 少妇被粗大猛烈的视频| 春色校园在线视频观看| 久久亚洲国产成人精品v| 日韩制服骚丝袜av| 一进一出抽搐动态| 国产精品国产高清国产av| 国产精品三级大全| 精品久久久久久成人av| 国产高潮美女av| 两个人视频免费观看高清| 亚洲人成网站高清观看| 成人三级黄色视频| 亚洲最大成人手机在线| 国产午夜精品论理片| 久久久久久久久大av| 人妻系列 视频| 国产精品1区2区在线观看.| 一级毛片电影观看 | 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 黄色一级大片看看| 日韩三级伦理在线观看| 成人鲁丝片一二三区免费| 亚洲电影在线观看av| 麻豆成人av视频| 欧美人与善性xxx| 国产精品福利在线免费观看| a级毛片a级免费在线| 午夜激情福利司机影院| 97超碰精品成人国产| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 午夜爱爱视频在线播放| 小说图片视频综合网站| 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲av一区综合| 久久人妻av系列| 看非洲黑人一级黄片| 精品人妻熟女av久视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 成人二区视频| 色哟哟哟哟哟哟| 卡戴珊不雅视频在线播放| 在线播放无遮挡| 国产私拍福利视频在线观看| 久久99热6这里只有精品| 两个人的视频大全免费| 国产精品久久久久久av不卡| 尾随美女入室| 黑人高潮一二区| 亚洲人成网站在线播| 久久欧美精品欧美久久欧美| 1024手机看黄色片| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产成人freesex在线| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 精品国内亚洲2022精品成人| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 亚洲国产高清在线一区二区三| 少妇的逼好多水| 桃色一区二区三区在线观看| www.av在线官网国产| 99久久中文字幕三级久久日本| 欧美色视频一区免费| 免费av观看视频| 看非洲黑人一级黄片| 亚洲av免费高清在线观看| 18+在线观看网站| 日本色播在线视频| 99久久精品国产国产毛片| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 黄片无遮挡物在线观看| 一级二级三级毛片免费看| 成年av动漫网址| av.在线天堂| 国产精品爽爽va在线观看网站| 91精品国产九色| 小说图片视频综合网站| 一级二级三级毛片免费看| 久久久a久久爽久久v久久| 蜜臀久久99精品久久宅男| 性色avwww在线观看| 国产午夜精品论理片| 国产一区亚洲一区在线观看| 久久草成人影院| 日本-黄色视频高清免费观看| 午夜亚洲福利在线播放| 国产色婷婷99| 成人国产麻豆网| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲经典国产精华液单| 国产精品爽爽va在线观看网站| 午夜久久久久精精品| 日韩欧美精品v在线| 日韩高清综合在线| 国产探花极品一区二区| 国国产精品蜜臀av免费| 久久精品国产亚洲av天美| 大型黄色视频在线免费观看| 美女内射精品一级片tv| 国产精品不卡视频一区二区| 免费电影在线观看免费观看| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 日本黄大片高清| av卡一久久| 午夜视频国产福利| 久久99热这里只有精品18| 美女高潮的动态| 欧美一区二区精品小视频在线| 97热精品久久久久久| 国产精品1区2区在线观看.| 欧美成人a在线观看| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产精品女同一区二区软件| 日韩视频在线欧美| 99久久精品热视频| 99热6这里只有精品| 人体艺术视频欧美日本| www日本黄色视频网| 春色校园在线视频观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 亚洲精品国产成人久久av| 最近最新中文字幕大全电影3| 少妇丰满av| 干丝袜人妻中文字幕| 亚洲av中文av极速乱| 在现免费观看毛片| 在线a可以看的网站| 岛国在线免费视频观看| 日韩成人伦理影院| 精品久久国产蜜桃| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 久久久久性生活片| 色哟哟哟哟哟哟| 最后的刺客免费高清国语| 色综合色国产| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产精品人妻久久久久久| 亚洲内射少妇av| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲av男天堂| 久久精品国产亚洲av天美| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 中文字幕精品亚洲无线码一区| 色哟哟哟哟哟哟| 男人的好看免费观看在线视频| 白带黄色成豆腐渣| 一区二区三区四区激情视频 | 国产一区二区在线av高清观看| 国产高清三级在线| 久久精品国产清高在天天线| 久久久久久久久久久丰满| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 干丝袜人妻中文字幕| av天堂在线播放| 精品无人区乱码1区二区| 国产乱人视频| 久99久视频精品免费| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产老妇伦熟女老妇高清| 熟女电影av网| 一级毛片我不卡| 国产精品1区2区在线观看.| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 嫩草影院新地址| 一个人看视频在线观看www免费| 深爱激情五月婷婷| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 亚洲,欧美,日韩| 我要搜黄色片| 成人永久免费在线观看视频| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产午夜精品一二区理论片| 乱人视频在线观看| 日韩在线高清观看一区二区三区| 成人漫画全彩无遮挡| 国产午夜精品论理片| 亚洲av第一区精品v没综合| 日本熟妇午夜| 91久久精品国产一区二区成人| 国产免费男女视频| 天美传媒精品一区二区| 看免费成人av毛片| 男女视频在线观看网站免费| 国产毛片a区久久久久| 99国产精品一区二区蜜桃av|