醬油三角瓶種中性蛋白酶活力不穩(wěn)定原因分析
2013-04-15 01:20:34安彩華
安彩華
【摘 要】米曲霉菌種蛋白酶活力對(duì)醬油發(fā)酵階段出油至關(guān)重要，成曲的酶活力強(qiáng)，有利于提高原料的利用率，促進(jìn)制曲和發(fā)酵階段的分解作用。但在生產(chǎn)中三角瓶種中性蛋白酶活力不穩(wěn)定，給生產(chǎn)原料利用率帶來(lái)了損失。本實(shí)驗(yàn)從三個(gè)方面研究對(duì)中性蛋白酶活力的影響。
【關(guān)鍵詞】米曲霉；中性蛋白酶活力；斜面菌種；三角瓶菌種；孢子數(shù)
0.引言
醬油是原料經(jīng)蒸熟冷卻，接入純粹培養(yǎng)的米曲霉菌種制成醬曲，醬曲移入發(fā)酵池，加鹽水發(fā)酵，待醬醅成熟后，以浸出法提取醬油。制曲的目的是使米曲霉在曲料上充分生長(zhǎng)發(fā)育，并大量產(chǎn)生和積蓄所需要的酶，如蛋白酶、肽酶、淀粉酶、谷氨酰胺酶、果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶等。在發(fā)酵過(guò)程中味的形成是利用這些酶的作用。如蛋白酶及肽酶將蛋白質(zhì)水解為氨基酸，產(chǎn)生鮮味；谷氨酰胺酶把無(wú)味的谷氨酰胺變成具有鮮味的俗谷氨酸；淀粉酶將淀份水解成糖，產(chǎn)生甜味；果膠酶、纖維素酶和半纖維素酶等能將細(xì)胞壁完全破裂，使蛋白酶和淀粉酶水解等更徹底[1]。本實(shí)驗(yàn)的目的就是在三角瓶階段獲得大量的純菌種，菌絲發(fā)育健壯，產(chǎn)酶能力強(qiáng)、孢子數(shù)量多、孢子的耐久性強(qiáng)、發(fā)芽率高，為種曲提供優(yōu)良的種子。
1.實(shí)驗(yàn)材料與方法
1.1實(shí)驗(yàn)材料、儀器、培養(yǎng)條件
1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
斜面菌種、麥糠、米粕、小麥面粉、500ml三角瓶、孢子數(shù)。
1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器
電子分析天平（0.1mg）（A&D;）；721分光光度計(jì)（河南兄弟儀器設(shè)備有限公司）；水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療器械）；微量可調(diào)移液槍（Finnpiptte）；血球計(jì)數(shù)板（上海醫(yī)樂醫(yī)用光學(xué)儀器廠）
1.1.3培養(yǎng)條件
接完種后，在培養(yǎng)室28-300C培養(yǎng)，72小時(shí)成曲。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
本實(shí)驗(yàn)采用四種實(shí)驗(yàn)方案：
（1）不同斜面菌種實(shí)驗(yàn)：用不同的煮豆方法煮出的豆汁配制斜面進(jìn)行斜面接種，待斜面成熟后進(jìn)行感官檢驗(yàn)和發(fā)芽率實(shí)驗(yàn)，剔除不合格斜面。然后用合格斜面接種三角瓶，放在培養(yǎng)室28-30°C培養(yǎng)。做成曲的的孢子數(shù)和蛋白酶活力的測(cè)定。
（2）三角瓶種配方實(shí)驗(yàn)：麥糠、米粕、面粉按照一定比例配制，加總量的93%的水，待放置30分鐘過(guò)后進(jìn)行攪拌分料，滅菌接種培養(yǎng)28-30°C，72小時(shí)成曲。測(cè)成曲的孢子數(shù)和中性蛋白酶活力。
（3）三角瓶種量實(shí)驗(yàn)：用基礎(chǔ)配方麥糠：米粕：面粉=75：17：8，加水量93%，不同接種量，培養(yǎng)28-30°C，72小時(shí)成曲。測(cè)成曲的孢子數(shù)和中性蛋白酶活力。
1.2.2中性蛋白酶活力測(cè)定方法
取試管兩只，每只試管加入樣品稀釋液1ml，置于40度水浴中預(yù)熱2min，再各加入經(jīng)同樣預(yù)熱的酪蛋白5ml，精確保溫10min。時(shí)間到后，各管立即加入0.4mol/L三氯醋酸5ml，以終止反應(yīng)。繼續(xù)水浴中保溫20min，使殘余蛋白質(zhì)沉淀后離心分離或過(guò)濾。取濾液用751分光光度計(jì)在275nm處測(cè)定其吸收度。
空白實(shí)驗(yàn)2測(cè)定方法同上，唯在加酪蛋白之前先加0.4mol/L三氯醋酸5ml，使酶失活，在加酪蛋白。
計(jì)算：在40度下每1min水解酪蛋白產(chǎn)生1Ug酪氨酸，定義為一個(gè)蛋白酶活力單位。
蛋白酶活力單位=ΔA/10× 11×K×N
K：常數(shù)，吸光度為1時(shí)蛋白酶活力單位，由酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線得出；
N：為稀釋倍數(shù)。
1.2.3孢子數(shù)的測(cè)定[2]
取潔凈干燥的血球計(jì)數(shù)板蓋上蓋玻片，用無(wú)菌滴管取孢子稀釋液1小滴滴于蓋玻片的邊緣處（不宜過(guò)多），讓滴液自行滲入計(jì)數(shù)室中，注意不可有氣泡產(chǎn)生。若有多余液滴，可用吸水紙吸干，靜止5min，待孢子沉降。 用高倍鏡頭觀察四個(gè)角上的4個(gè)中格（即100個(gè)小格）的孢子數(shù)。
16×25的計(jì)數(shù)板
孢子數(shù)（個(gè)/g）=（N/100） ×400×10000×（V/G）=4×104×（NV/G）…… （1）
式中N—100小格內(nèi)孢子總數(shù)（個(gè)）；
V—孢子稀釋液體積（ml）；
G—樣品重量（g）。
2.結(jié)果與討論
2.1不同斜面菌種對(duì)三角瓶種中性蛋白酶活力的影響
表一
備注：斜面I3和J為舊的煮豆方法，斜面I1 和J1為新的煮豆方法；I1和I3、J1和J3為同一個(gè)斜面。
結(jié)論：從以上數(shù)據(jù)可以看出，煮豆方法的改變所配制的斜面菌種對(duì)三角瓶種成曲中性蛋白酶活力影響不大；孢子數(shù)多的菌種蛋白酶活力高。
2.2 不同培養(yǎng)基配方對(duì)三角瓶種中性蛋白酶活力的影響
表二
（備注：第一次實(shí)驗(yàn)所用斜面批號(hào)為A060217-2G；第二、三次實(shí)驗(yàn)所用斜面批號(hào)均為A060223-I1和A060223-I3。配方一、配方五與配方六生長(zhǎng)較快。）
結(jié)論：合適的碳氮比可以提高三角瓶種中性蛋白酶活力，孢子數(shù)多的斜面其三角瓶成曲中性蛋白酶活力高；再次證明孢子數(shù)多的菌種蛋白酶活力高。
2.3不同接種量對(duì)三角瓶種中性蛋白酶活力的影響
表三
（備注：本次實(shí)驗(yàn)所用斜面批號(hào)為A060227-2K。）
結(jié)論：從以上實(shí)驗(yàn)可以看出，合適的接種量可以提高菌種的蛋白酶活力。接種量太少，菌種生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充足，容易出現(xiàn)氣生菌絲；接種量太大，菌種生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不夠，對(duì)菌種的生長(zhǎng)造成影響，蛋白酶活力低。
3.結(jié)論
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：
（1）不同的煮豆方法配制的斜面對(duì)三角瓶種中性蛋白酶活力影響不大。制作斜面用的培養(yǎng)基主要是豆汁，添加一些微量元素。從實(shí)驗(yàn)中可以看出，煮豆方法的改變并沒有改變豆汁中營(yíng)養(yǎng)素的改變和一些糖類的改變。
（2）培養(yǎng)基配方的改變對(duì)三角瓶種中性蛋白酶活力影響較大。我們添加米粕、麥糠主要目的是提供菌種生長(zhǎng)所需的碳源和氮源和微量元素、無(wú)機(jī)鹽。氨基酸等。而且麥糠質(zhì)地疏松，表面積大，營(yíng)養(yǎng)成分適于促進(jìn)米曲霉的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶。
（3）適當(dāng)?shù)慕臃N量可以提高成曲蛋白酶活力。接種量太大，生長(zhǎng)所需的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏，導(dǎo)致成曲色澤不均，孢子數(shù)較少，包子發(fā)芽率低；接種量低，菌種生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)過(guò)于旺盛，再生菌絲過(guò)多，成曲長(zhǎng)白毛結(jié)塊嚴(yán)重，造成成曲孢子數(shù)、發(fā)芽率、蛋白酶活力低。我們?cè)谏a(chǎn)中要嚴(yán)格把控三角瓶中的質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)成曲質(zhì)量低要嚴(yán)格去掉，不能用于生產(chǎn)。
（4）孢子數(shù)影響蛋白酶活力。孢子數(shù)多的成曲蛋白酶活力相應(yīng)增高。
（5）從表二和表三種可以看出，適當(dāng)提高培養(yǎng)基的加水量，可以提高成曲蛋白酶活力。水分適當(dāng)，不僅對(duì)包子發(fā)芽有利，而且為以后產(chǎn)酶多、酶活性強(qiáng)創(chuàng)造了條件。
【參考文獻(xiàn)】
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[3]天津輕工業(yè)學(xué)院，無(wú)錫輕工業(yè)大學(xué)合編.食品微生物學(xué).1980.
