茅莓提取物體內(nèi)抗乙型肝炎病毒的實驗研究

柳勤譯，陳曉武，楊小喬，許鳴

(廣東省第二人民醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 廣州 510317)

乙型肝炎是一種全球性分布的病毒傳染病，其感染面廣，傳染性強(qiáng)，易慢性化。我國每年約有40萬人死于與慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，HBV)相關(guān)的疾病，抗病毒治療是治療HBV最主要的治療措施，目前國內(nèi)外公認(rèn)批準(zhǔn)有效的抗HBV藥物主要包括干擾素類[1]和核苷(酸)類似物(nucleoside analogues，NA)，但單一抗病毒藥如干擾素需注射治療，不良反應(yīng)較大，不適用于肝硬化失代償期和白細(xì)胞及血小板明顯減少的肝病患者；核苷類藥物，其中以拉米夫定療效最為確切。細(xì)胞研究證實，拉米夫定能有效抑制HBV復(fù)制，但僅僅抑制病毒DNA的復(fù)制量及其復(fù)制中間體的產(chǎn)量，核苷類藥物療程難以確定，因此在停止用藥后可發(fā)生反跳，長期應(yīng)用可產(chǎn)生耐藥突變，且副作用大，費用高。與干擾素和核苷類藥物相比，傳統(tǒng)中藥在長期治療HBV過程中體現(xiàn)了其療效穩(wěn)定、毒副作用小的獨特優(yōu)勢。中草藥治療HBV的有效性在于它具有促進(jìn)肝臟細(xì)胞的修復(fù)、保護(hù)細(xì)胞膜、調(diào)節(jié)免疫功能和抑制病毒復(fù)制等方面的作用。茅莓是一種傳統(tǒng)民間中藥，據(jù)《中藥大辭典》記載，茅莓的根、莖和葉均可藥用，用于治療肝脾腫大、黃疸、慢性肝炎等[2]。目前有國內(nèi)外學(xué)者報道茅莓提取物(乙酸乙酯部分)對HBsAg和HBeAg兩種抗原的表達(dá)均有抑制作用，但尚無茅莓提取物(乙酸乙酯部分)在體內(nèi)抗乙型肝炎病毒相關(guān)方面的報道，為此進(jìn)行本研究。

1 材料與方法

1.1 藥物 受試藥物茅莓提取物(乙酸乙酯部分)，為粉末劑由南方醫(yī)科大學(xué)藥理教研室提供。陽性藥選擇：選擇對鴨乙型肝炎病毒(duck hepatitis B virus，DHBV)抑制作用較強(qiáng)的拉米夫定作為陽性對照藥，規(guī)格0.1 g，中國蘇州葛蘭素史克制藥(蘇州)有限公司生產(chǎn)，批號：H20070581。

1.2 動物 3日齡麻鴨，購自廣西臨桂縣五通鎮(zhèn)孵化場，體重約50 g/只，常規(guī)飼養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20～25 ℃，相對濕度60%～80%，定時通風(fēng)換氣，每日約12 h光照。飼料：寶鼎501小鴨飼料，由穗屏企業(yè)有限公司飼料廠生產(chǎn)，40 kg/包。

1.3 主要試劑及儀器 Taq酶，10×PCR buffer、dNTP mixture、6×loading buffer，均購自北京賽百盛生物工程有限公司。引物由北京賽百盛生物工程有限公司合成，梯度聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)儀，mastercycler gradint 型號5331。高速離心機(jī)，Eppenolf 型號5415D。Dyy-6C型電泳儀。NC膜：購自Amersham公司；DHBV質(zhì)粒：由廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶病研究所病毒室提供；缺口翻譯藥盒：購自promega公司；α-32 p-dCTP，購自北京亞輝公司；Sephadex G-50：購自Pharmacia公司；96孔雜交點樣器：美國Bio-rad公司產(chǎn)品；蓋革氏計數(shù)器：美國S.E.International 公司產(chǎn)品。常規(guī)HE染色所需試劑由南方醫(yī)科大學(xué)組胚教研室提供。

1.4 方法

1.4.1 模型篩選 DHBV陽性鴨子的篩選：3日齡麻鴨200只于第2天經(jīng)脛靜脈取血，分離血清后，用常規(guī)PCR方法檢測DHBV，第5天出結(jié)果，篩選出先天感染DHBV鴨65只。

1.4.2 分組與給藥 取經(jīng)PCR方法篩選出的先天感染DHBV鴨50只，隨機(jī)分為5組，每組10只：茅莓提取物400、200、100 mg/kg組，生理鹽水對照組1 ml/kg；拉米夫定50 mg/kg組，每天灌胃2次，連續(xù)灌胃21 d。

1.4.3 取樣方法 在給藥前(T0)，用藥后7 d(T7)、14 d(T14)、21 d(T21)，停藥后3 d(P3)、7 d(P7)自脛靜脈取血分離血清，-20 ℃凍存待檢。停藥7 d后將實驗動物全部頸動脈放血處死，立即摘取肝臟，取肝右葉相同部位組織0.5 cm×0.5 cm大小，用10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋切片，HE染色待檢。

1.4.4 DHBV-DNA 檢測方法取上述鴨血清采用斑點雜交法，每批同時點膜，測定鴨血清中DHBV-DNA水平的變化，按缺口翻譯試劑盒說明書方法，用32P標(biāo)記DHBV-DNA探針，并作鴨血清DNA斑點雜交，放射自顯影膜片斑點，在酶標(biāo)檢測儀上測定OD值(濾光片波長為490 nm)，計算鴨血清DHBV-DNA密度。

1.4.5 肝組織病理學(xué)觀察 參照2001年《病毒性肝炎防治方案》及目前國際上常用Knodell HAI、Ishak、Scheuer 和Chevallier 等評分系統(tǒng)或半定量計分方案，了解肝臟炎癥病理變化程度，以及評價藥物療效。本實驗觀察指標(biāo)：細(xì)胞水腫、氣球樣變、間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤、點狀壞死。400倍光學(xué)顯微鏡下觀察HBV肝組織：(1)細(xì)胞水腫：不出現(xiàn)者為(-)；占肝小葉1/2～1/3者為(+)；占肝小葉1/2以上者為(++)；肝小葉廣泛水腫者為(+++)。(2)氣球樣變：評分同細(xì)胞水腫。(3)間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤：未見者為(-)；偶見者為(+)；廣泛可見者為(+++)；居于(+)與(+++)之間者為(++)。(4)壞死：不出現(xiàn)為(-)；肝小葉出現(xiàn)1～2個壞死灶者為(+)；出現(xiàn)3～4個壞死者(++)，出現(xiàn)4個以上壞死灶者為(+++)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析，多組計量資料分析采用One-way ANOVA，多重比較采用最小顯著差數(shù)法(least significant difference，LSD)；雙向有序等級資料采用線趨勢檢驗，兩兩比較采用S-N-K法。

2 結(jié)果

2.1 鴨血清DHBV-DNA檢測結(jié)果 鹽水對照組動物血清DHBV-DNA水平穩(wěn)定。拉米夫定口服21 d可顯著抑制血清DHBV-DNA，停藥3 d和7 d后DHBV-DNA顯著回升。茅莓提取物各劑量組各時點血清DHBV-DNA變化差異無顯著性，見表1。

表1 茅莓提取物在鴨體內(nèi)對DHBV-DNA的抑制作用

注：與對照組相同時間比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與同組T0比較：3)P<0.01

2.2 肝組織病理學(xué)顯微鏡觀察 茅莓提取物大劑量組的鴨肝組織內(nèi)可見重度細(xì)胞水腫，但氣球樣變較其他各組輕，未見壞死、纖維化和間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤。對照組及各藥物組動物均可見肝細(xì)胞重度細(xì)胞水腫、氣球樣變性，幾乎無點灶狀及碎屑樣壞死，無纖維增生，可見輕度間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤，這些病理表現(xiàn)各組差異無顯著性(P>0.05)，見表2。

表2 各組鴨肝病理變化結(jié)果

注：各組肝組織病理檢查，P>0.05

3 討論

HBV屬于嗜肝DNA病毒科，這個家族的所有病毒都很小，嗜肝性，毒粒形態(tài)和基因組相似，復(fù)制經(jīng)RNA逆轉(zhuǎn)錄，毒粒形態(tài)和基因組相似，復(fù)制經(jīng)RNA逆轉(zhuǎn)錄。一些哺乳動物和禽類嗜肝病毒的發(fā)現(xiàn)為人類研究人乙型肝炎病毒的生物學(xué)相關(guān)機(jī)制提供了實驗和道德倫理上的便利。由于禽類嗜肝病毒的DHBV與人乙型肝炎病毒均屬于嗜肝病毒科，兩者在毒粒形態(tài)、結(jié)構(gòu)、基因組成、復(fù)制及傳播方式等方面均很相似[3-5]。國內(nèi)目前多選用后天感染的鴨為肝炎的動物模型。國外學(xué)者目前普遍采用DHBV感染1～3日齡雛鴨建立乙型肝炎動物模型，通過比較，先天感染DHBV的雛鴨較后天感染模型的血清病毒持續(xù)時間長，病毒滴度高；對肝組織的炎性反應(yīng)長期存在，細(xì)胞病變較為明顯，其病毒血癥持續(xù)時間較長且較穩(wěn)定，無明顯的自然轉(zhuǎn)陰現(xiàn)象，是研究人類乙型肝炎發(fā)病機(jī)制、病毒復(fù)制過程及篩選有效治療藥物的理想動物模型[6]。本研究發(fā)現(xiàn)：鹽水對照組鴨血清DHBV-DNA水平穩(wěn)定，陽性藥物拉米夫定可顯著抑制血清DHBV-DNA，停藥3 d和7 d DHBV-DNA顯著回升，與國內(nèi)外報道的結(jié)果和臨床結(jié)果都相吻合。國內(nèi)外學(xué)者報道茅莓提取物(乙酸乙酯部分)對HBsAg和HBeAg兩種抗原的表達(dá)均有抑制作用，且在96 h達(dá)高峰，并呈現(xiàn)濃度依賴性和時間依賴性，這說明茅莓提物(乙酸乙酯部分)在體外有抗乙型肝炎病毒的作用，然而在體內(nèi)茅莓提取物(乙酸乙酯部分)各劑量組21 d療程各時點血清DHBV-DNA變化差異無顯著性[7-8]。這結(jié)果顯示茅莓提取物經(jīng)過體內(nèi)代謝后在鴨體內(nèi)對DHBV-DNA無抑制作用?？紤]原因有：(1)茅莓提取物在體內(nèi)確實無抗病毒作用，與國內(nèi)報道的有相當(dāng)多的藥物體外有抑制病毒復(fù)制作用，而體內(nèi)并無抗病毒作用相一致。(2)給藥劑量不足不能達(dá)有效血藥濃度，茅莓提取物在細(xì)胞試驗中已表現(xiàn)出對HBsAg和HBeAg的表達(dá)抑制，并呈現(xiàn)出濃度依賴性和時間依賴性。(3)給藥途徑的影響，茅莓提取物在給鴨灌胃經(jīng)鴨體內(nèi)代謝后抗病毒的有效成分可能已經(jīng)被破壞。(4)給藥時間可能太短，目前常用兩大類抗病毒藥物都需要長期用藥，作用機(jī)制不同，藥物起效需要的時間也不一樣。

綜上所述，本實驗研究中發(fā)現(xiàn)：茅莓提取物(乙酸乙酯部分)抗乙型肝炎病毒作用主要是通過其原形發(fā)揮作用，該原形在麻鴨體內(nèi)經(jīng)過代謝后，失去抗乙型肝炎病毒的作用。

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