幼鼠膈肌損傷與漏斗胸發(fā)生的實驗研究

嚴文靜，吳學東，李俊*

（1.大理學院護理學院，云南大理671000；2.大理學院附屬醫(yī)院，云南大理671000）

幼鼠膈肌損傷與漏斗胸發(fā)生的實驗研究

嚴文靜1，吳學東2，李俊2*

（1.大理學院護理學院，云南大理671000；2.大理學院附屬醫(yī)院，云南大理671000）

目的：探討幼鼠膈肌損傷后與漏斗胸（PE）發(fā)生的關系。方法：將40只SD大鼠分成2組，實驗組造成人為膈肌損傷，對照組施以假手術，至鼠齡12周全部處死觀察胸廓外觀及膈肌組織學形態(tài)。結果：膈肌損傷后，動物PE發(fā)生率為38.89%（7/18），實驗組動物PE的發(fā)生率與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義。膈肌損傷后組織愈合結果為肌纖維結構松散、部分肌組織萎縮，纖維結締組織增生，瘢痕形成。結論：膈肌損傷后瘢痕愈合引起膈肌攣縮，攣縮的膈肌持續(xù)牽拉前胸壁，牽拉力量是導致大鼠PE發(fā)生的主要因素之一。

膈肌損傷；漏斗胸；實驗研究；SD大鼠

漏斗胸（Pectus Excavatum，PE）是小兒最常見的前胸壁凹陷畸形，其病因和發(fā)病機制至今尚不清楚，有學者提出過前方膈肌纖維化病因假說〔1〕，但未見進一步的研究報告。膈肌通過收縮與舒張造成對胸壁的牽拉、改變胸廓內負壓而完成呼吸運動，故探討膈肌損傷對胸廓發(fā)育的影響將可能是闡明PE發(fā)生機制的途徑。本研究通過手術造成幼年（Sprague Dawley SD）大鼠膈肌損傷，并對膈肌損傷后的組織愈合和術后動物前胸壁畸形（PE）的情況進行觀察，以期闡釋膈肌攣縮與生長發(fā)育期幼鼠PE發(fā)生的關系。

1 材料和方法

1.1 實驗材料4周齡SD大鼠40只，許可證號：SCXK（滇）2005-0007。10%水合氯醛溶液，95%醫(yī)用乙醇，萊卡石蠟切片機，泰克顯微圖像分析儀（TECHPanasonic SDⅡ型）。

1.2 動物分組及手術40只4周齡SD大鼠，隨機分成實驗組和對照組，每組各20只，實驗組經手術造成膈肌損傷，對照組僅以假手術作為對照。實驗組用10%水合氯醛溶液腹膜腔麻醉后右上腹沿肋緣斜行入路，找到右側膈肌胸骨部及膈肌肋部大部分，用注射器穿刺膈肌并注射95%乙醇0.02 mL，以漿膜下注射為度，術中不能刺穿膈肌，并在注射部位以95%乙醇涂擦做為加強。對照組麻醉成功后，僅以右上腹斜切口進入腹腔后不進行任何干預后關腹。術后籠內飼養(yǎng)至鼠齡12周后全部處死。

1.3 取材和組織學研究術后觀察記錄胸廓外觀變化，兩組動物于鼠齡12周時全部處死，取膈肌胸骨部及右肋部組織作HE染色。在顯微鏡下與對照組比較觀察膈肌肌細胞的組織學形態(tài)結構。

1.4 統(tǒng)計學分析方法前胸壁畸形發(fā)生率的比較采用χ2檢驗；統(tǒng)計學分析用SPSS17.0軟件完成，以P< 0.05為檢驗有統(tǒng)計學意義。

2 結果

實驗組20只大鼠實際獲得觀察18只，因在鼠齡滿8周前共死亡2只，均因術后2周后發(fā)生膈疝，未發(fā)生PE。術后直至12周處死時生長狀態(tài)良好，共出現(xiàn)PE7只。對照組無動物死亡，亦無PE發(fā)生。

2.1 PE的發(fā)生率膈肌損傷術后1周內大鼠前胸壁外觀無明顯變化；術后2周實驗組有7只SD大鼠切口上方前胸壁出現(xiàn)輕度的PE；至鼠齡8周PE隨周齡增加有所加重，而鼠齡8周后PE趨于穩(wěn)定，見圖1。在鼠齡12周處死時，7只大鼠PE外觀未見好轉及加重，其余動物未出現(xiàn)PE。對照組未發(fā)生PE。實驗組PE發(fā)生率為38.89%，兩組發(fā)生率經χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。

圖1 右肋下胸廓不規(guī)則凹陷

表1 兩組前胸壁外觀觀察結果

2.2 膈肌損傷后組織愈合情況膈肌損傷的大鼠（取材為術后2周因膈疝死亡的大鼠標本）術后第2周時，肉眼下膈肌組織的手術區(qū)域與肝臟膈面黏連，且肉芽組織增生，色鮮紅，顆粒狀，柔軟濕潤，膈肌不規(guī)則增厚，光鏡下手術區(qū)域見新生肉芽組織增生，新生壁薄的毛細血管豐富及增生的成纖維細胞，并有聚集成團、深染的炎性細胞浸潤；取材鼠齡12周的標本，膈肌組織手術區(qū)域與肝臟膈面嚴重黏連，不易分離，表面凹凸不平，局部呈收縮狀態(tài)，顏色較周圍正常組織蒼白，肌肉質地稍硬，彈性較差。光鏡下組織內幾乎無血管，由大量的平行或交錯分布的膠原纖維束組成，纖維束呈均質紅染即玻璃樣變，部分肌組織萎縮，肌纖維結構松散，走行紊亂，纖維結締組織比例增多，見圖2。對照組膈肌表面光滑，顏色粉紅，柔軟彈性好，光鏡下纖維呈細長的圓柱狀或棱柱狀，排列致密、走行規(guī)則，見圖3。解剖大鼠胸腔觀察，膈肌組織手術區(qū)域與胸膜腔及腔內臟器均未發(fā)生黏連。

圖2 肌萎縮橫切面HEx100

圖3 正常膈肌橫切面HEx100

3 討論

人類PE畸形約90%可在出生后1年內發(fā)現(xiàn)，隨年齡增大而加重，畸形變得不對稱〔2〕。典型表現(xiàn)為深吸氣時有胸骨向脊椎方向凹陷的異常反應〔3〕。許多學者提出了多種病因假說或學說〔4-5〕，但PE的病因和發(fā)病機制至今仍未闡明〔6〕，因此嚴重制約了臨床對PE本質的認識和防治措施的實施。絕大多數(shù)PE出現(xiàn)于出生之后一年內，這提示在從胎兒到新生兒的轉變過程中，特別是肺呼吸功能的啟動，氣道、肺、呼吸肌和骨性胸廓的發(fā)育狀況、各自功能的開始及它們之間工作的協(xié)調性等，都可能在PE的發(fā)生過程中起作用〔7〕。

3.1 膈肌攣縮后的病理生理改變骨骼肌纖維是高度分化的細胞，再生能力很弱。若遭受損傷纖維斷裂肌膜被破壞，將不能再生而由結締組織增生充填，形成疤痕修復。膈肌具有骨骼肌的生理結構及功能，可參考其他骨骼肌的攣縮機制，結合本實驗膈肌攣縮后的病理改變，探討可能發(fā)生的膈肌形態(tài)及功能改變。臨床上有關骨骼肌攣縮的探討，較多的有臀肌攣縮等疾病，基本病理變化為骨骼肌纖維化，肌纖維的退行性變性和肌纖維纖維化，瘢痕組織形成，導致機體外觀改變及骨骼肌功能減退〔8〕，與本實驗膈肌的組織學病理改變相似。王靖等〔9〕對本實驗的PE幼鼠膈肌，通過SDS聚內烯酰胺凝膠電泳結合westem印跡分析，檢測膈肌MyHC-Ⅱa的表達發(fā)現(xiàn)，膈肌肌凝蛋白重鏈MyHC-Ⅱa表達減少，提示在PE形成過程中發(fā)生了膈肌纖維結構和功能的改變。

3.2 SD大鼠PE的觀察目前尚無SD大鼠PE的評判及分級標準，本實驗通過測量大鼠胸廓前后徑和橫徑，并參照人類評價胸廓形狀的胸廓橫徑與前后徑之比值進行觀察發(fā)現(xiàn)，實驗組動物胸廓有從桶狀胸向扁平胸再向PE改變的趨勢，這與文獻〔10〕報道在小兒PE病例中扁平胸與漏斗胸并存，且年齡越大胸廓扁平程度越明顯的結論一致。正常大鼠的胸廓為前后徑大于橫徑的類似雞胸狀〔11〕，且為匍匐爬行狀態(tài)，肋骨在長期重力作用下生長，較人類更不易發(fā)生前胸壁凹陷，本實驗手術實施后，以自然方式籠養(yǎng)未采用限制性仰臥體位，仍有7只大鼠出現(xiàn)PE，這說明手術干預方式對PE的形成是有效的。

3.3 膈肌攣縮后漏斗胸形成的機制在幼鼠期有兩方面的解剖生理因素，可能促進了PE的發(fā)生。一是初生時的呼吸運動主要靠膈肌的舒縮來實現(xiàn)，故膈肌的牽拉對胸廓的影響相對強大。二是肋軟骨及胸骨處于生長發(fā)育期，前胸壁骨性組成以軟骨結構為主，抗彎曲能力較弱〔11〕，脆弱的胸廓塑型尚未穩(wěn)定?；谝陨蟽蓚€因素，損傷后的膈肌，因攣縮而增強了對前胸壁肋骨附著點牽拉的力量，在持久向后牽拉的作用下，胸骨旁下位肋骨向脊柱方向凹陷，胸廓重新塑型并固定，形成PE。吳學東〔12〕通過切斷SD大鼠胸骨旁下位3對肋軟骨，復制出PE動物模型，并認為PE成因與膈肌對前下胸壁的牽拉作用有關。在本實驗中有38.89%的動物出現(xiàn)PE，而對照組未發(fā)生，提示攣縮的膈肌向后牽拉相應肋骨，能誘發(fā)生長發(fā)育期的幼鼠發(fā)生PE。同時，術后膈肌組織手術區(qū)域與鄰近的肝臟膈面嚴重黏連后，加固膈肌的攣縮，膈肌呼吸運動被限制，也可能在PE的形成過程中起到一定的推動作用。

實驗組大鼠8周齡前出現(xiàn)PE7例，生長至12周齡時PE畸形并無進展或消退，同時也未發(fā)現(xiàn)有新增畸形例數(shù)，結合大鼠生長發(fā)育規(guī)律分析，在8周齡后大鼠已從幼鼠過渡為成鼠，骨骼不再增粗增長，骨性胸廓基本固定，由此可推測，攣縮的膈肌持續(xù)牽拉而造成PE主要在8周齡前形成，8周齡可能是干預的分界點與關鍵點。

3.4 實驗研究的拓展空間在本實驗中并非所有實施膈肌損傷的大鼠都形成了PE，這提示PE不是由單一原因引起的單純的疾病〔13〕，而是多種疾病共有的一個臨床表現(xiàn)，因此仍然存在PE的眾多病因假說（如膈肌中心腱短縮、部分前方膈肌纖維化、骨和肋軟骨發(fā)育障礙、結締組織異常等）〔14〕，目前還沒有一種假說能完全解釋PE的病因，但本實驗認為只要這些疾病能使膈肌產生足以持續(xù)向后牽拉胸骨、肋骨的力量，就有發(fā)生PE的可能。這就使我們有了可拓展的研究空間，在下一步PE的病因學探討中，應著眼于是什么原因或疾病導致膈肌肌力和方向的改變，以及從分子水平探究膈肌肌力是如何改變的。

〔1〕Lacquet LK.Morshuis WJ.Folgering HT Long-term result after correction of anterior chest wall deformities〔J〕. Cardiovasc Surg，1998，39（5）：683-688.

〔2〕劉文英.漏斗胸與雞胸的診治進展〔J〕.實用兒科臨床雜志，2012，27（11）：889-892.

〔3〕Park HJ.The Nuss procedure for pectus excavatum：evolution of techniques and early results on 322 patients〔J〕.Ann Thorac Surg，2004，77（1）：289-295.

〔4〕Fonkalsrud EW，Mendoza J.Open repair of pectus excavatum and carinatum deformities with minimal cartilage resection〔J〕.Am J Surg，2006，191（6）：779-784.

〔5〕Brodkin HA.Congenital anterior chest wall deformities of diaphragmatic origin〔J〕.Dis Chest，1953，24：259-277.

〔6〕吳學東，胡廷澤.嬰兒肋骨生長板損傷，胸壁軟化與前胸壁畸形的關系〔J〕.中華小兒外科雜志，2002，23（5）：476-478.

〔7〕吳學東，周炳昆，李莊，等.幼鼠呼吸道梗阻后前胸壁凹陷畸形〔J〕.大理學院學報，2008，7（8）：46-49.

〔8〕盧浩浩，劉國輝，楊述華.臀肌攣縮癥病因及診斷的研究發(fā)展〔J〕.中國矯形外科雜志，2007，15（3）：207-209.

〔9〕王靖，李俊，吳學東，等.獲得性漏斗胸膈肌肌凝蛋白重鏈MyHC一Ⅱa表達及其意義〔J〕.中華小兒外科雜志，2010，31（4）：285-288.

〔10〕李洪波，潘征夏，吳春，等.不同年齡段漏斗胸患兒手術前后胸廓的扁平程度〔J〕.實用兒科臨床雜志，2009，24（11）：824-826.

〔11〕吳學東，林春榕，胡廷澤，等.漏斗胸實驗研究中大鼠胸部的應用解剖〔J〕.中國比較醫(yī)學雜志，2004，14（2）：97-99.

〔12〕吳學東，胡廷澤，劉文英，等.漏斗胸動物模型的建立〔J〕.中華小兒外科雜志，2003，24（5）：458-459.

〔13〕吳學東，嚴文靜.膈肌形態(tài)與功能研究進展〔J〕.大理學院學報，2010，9（2）：91-95.

〔14〕馮杰雄，胡廷澤.漏斗胸病因學研究進展〔J〕.中華小兒外科雜志，2002，23（2）：172-173.

（責任編輯 李楊）

Experimental Study of the Pectus Excavatum after Diaphragm Injury in Juvenile Rats

YAN Wenjing1,WU Xuedong2,LI Jun2*
（1.College of Nursing,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China; 2.Affiliated Hospital of Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To study the relationship of diaphragmatic injury and pectus excavatum in rats.Methods:Forty SD rats were divided into 2 groups,intervene group received the operation of injury diaphragm,and the control group received the sham operation. At the age of 12 weeks,all rats were sacrificed for observations of the chest appearance and histology and morphology of diaphragm. Results:The incidence rate of the pectus excavatum in intervened SD rats was 38.89%（7/18）after diaphragm contracture. Compared to the control group,the incidence rates were different with statistic significance.The muscle fiber structure was loose and disordered;the muscular atrophy,hyperplasia of fibrous connective tissue and scar formation were found in diaphragm injure. Conclusion:Injuried diaphragm led to contracture after diaphragm cicatricle healing,the contracture of diaphragm created a continuous stretch power on anterior chest wall,the force may be one of the factors which induce pectus excavatum.

diaphragm injury;pectus excavatum;experimental research;SD rats

R332

A

1672-2345（2013）06-0027-04

10.3969/j.issn.1672-2345.2013.06.008

2013-01-26

2013-03-31

嚴文靜，講師，主要從事兒科臨床及兒童保健研究. *通信作者：李俊，副教授.