ABA及其合成抑制劑對喜樹幼苗喜樹堿及抗氧化酶的影響

武應(yīng)霞，畢會濤，李繼東，胡春瑞，馮建燦

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，河南 鄭州 450002；2.河南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450046）

喜樹Camptotheca accuminata是我國原產(chǎn)樹種，因能生產(chǎn)具有抗腫瘤活性的喜樹堿而受到關(guān)注。喜樹堿是次生代謝的產(chǎn)物，已完成的研究發(fā)現(xiàn)，正常條件下喜樹堿在喜樹中的含量很低，在水分脅迫條件下喜樹幼苗葉片的喜樹堿含量明顯升高[1]，同時其它環(huán)境因子對喜樹幼苗中喜樹堿含量的影響也得到了關(guān)注，如水漬和遮蔭[2]、光強[3]、增施氮磷鉀復(fù)合肥[4-5]。激素類物質(zhì)在調(diào)節(jié)植物初生長和發(fā)育的同時，對植物的次生代謝也有著重要的影響。如在黑莨菪轉(zhuǎn)化根培養(yǎng)中NAA對根的生長沒有影響，但是與沒有添加生長素的對照相比，生物堿的積累提高了1倍，即外源生長素不影響生長，但是可以增加生物堿的含量[6]。相反，在長春花的細胞懸浮培養(yǎng)中，去除2,4-D則可以增加喜樹堿的含量[7]。BA和水楊酸可以增加水培條件下喜樹中喜樹堿的含量，但由于生物量的降低，并沒有提高喜樹堿的總產(chǎn)量；NAA對喜樹堿的含量沒有影響，但是能降低喜樹堿的產(chǎn)量[8-9]。而茉莉酸甲酯和乙烯利也能在一定程度上增強喜樹堿的合成，而且因為誘導(dǎo)子含量不同而表現(xiàn)出一定的差異[10]。然而關(guān)于ABA對喜樹堿積累的影響的研究尚未見報道。

在對喜樹在水分脅迫下內(nèi)源ABA含量和喜樹堿含量的變化的研究中[11]，發(fā)現(xiàn)在脅迫下二者均隨著脅迫強度的增大和時間的延長而增高。然而，在水分脅迫下喜樹中ABA與喜樹堿含量變化之間是否存在某種關(guān)聯(lián)尚未可知。如果二者存在一定的聯(lián)系，那么就可以利用ABA來誘導(dǎo)和促進喜樹堿的合成，從而得到滿足需要的喜樹堿提取材料。

因此，本試驗中利用高分子滲透調(diào)節(jié)劑聚乙二醇（polyethylene，PEG）模擬干旱脅迫處理喜樹幼苗，使用ABA和ABA合成抑制劑氟啶酮（Fluridone）預(yù)處理喜樹幼苗，研究在此條件下喜樹幼苗內(nèi)ABA含量、喜樹堿含量及抗氧化酶活性的變化，以探討ABA在喜樹堿生物合成中所起的作用，以及ABA對抗氧化酶的誘導(dǎo)作用，旨在為喜樹堿的化學(xué)調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗采用4周齡喜樹實生幼苗為試驗材料。

喜樹種子采于河南省桐柏縣。挑選飽滿種子，用0.1%HgCl2消毒20 min，冷水浸種24 h，后與濕沙1∶1混合催芽，15 d后將種子與沙分離，把種子放在1個帶蓋容器內(nèi)再催芽。再過10 d，選取健壯幼苗定植到16 cm×22 cm塑料周轉(zhuǎn)箱內(nèi)，用泡沫板和脫脂棉固定，加入100 mL 1/2Hoagland營養(yǎng)液，每2 d換1次營養(yǎng)液。放入LRH-250-GSⅡ微電腦控制人工氣候箱中培養(yǎng)，光照時間為8:00～22:00，濕度70%，溫度25 ℃，每天早晚各通氣10 min。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設(shè)計

試驗中共設(shè)置4個處理：

（1）1/2 Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)（CK）；

（2）1/2 Hoagland營養(yǎng)液中加入15% PEG 6000 處理（PEG）；

（3）1/2 Hoagland營養(yǎng)液中加入15%PEG 6000處理＋10 μmol·L-1ABA處理（PEG＋ABA）；

（4）10 mmol·L-1氟啶酮營養(yǎng)液預(yù)處理24 h后再以15%PEG6000處理（PEG＋氟啶酮）。

每個處理重復(fù)3次。在處理開始0、12、24、36、48、60 h時分別取幼苗全株，分別用于超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化物酶（POD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性的分析。在60 h時取幼苗全株5 g左右用于喜樹堿（CPT）含量測定。在處理開始0、24、36、60 h時取幼苗全株1 g左右用于脫落酸（ABA）含量測定。

1.2.2 指標測定

超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定采用 NBT光照化學(xué)還原法[12]；過氧化物酶（POD）活性的測定采用愈傷木酚氧化法[13]；過氧化氫酶（CAT）活性采用高錳酸鉀滴定法測定[13]；喜樹堿含量的測定采用高效液相色譜法（HPLC法）；脫落酸（ABA）含量的測定采用酶聯(lián)免疫法（ELISA法）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)使用SPSS軟件進行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 對喜樹幼苗過氧化物酶（POD）活性的影響

POD 在植物體內(nèi)具有廣泛的作用，其主要作用之一是催化H2O2降解。各處理中喜樹幼苗內(nèi)POD活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢（見圖1）。在PEG處理中，POD活性在12 h時達到最大值106.8 U·g-1min-1，較同期對照值高61.08%，在60 h時下降到77.5 U·g-1min-1，較對照高21.85%。在PEG+ABA處理中，POD活性在12 h時達到最大值117.7 U·g-1min-1，較對照高77.53%，較PEG處理下最大值高10.21%，在60 h時下降到90.0 U·g-1min-1，較對照高41.51%。在PEG+氟啶酮處理中，POD活性在24 h時達到最大值87.3 U·g-1min-1，較對照高37.48%，較PEG處理下最大值低22.34%，到60 h時下降到72.4 U·g-1min-1，較對照高13.84%。外源ABA可以提高POD活性[14]，而ABA抑制劑使POD活性降低。

圖1 滲透脅迫對喜樹幼苗過氧化物酶(POD)活性的影響Fig.1 Effect of osmotic stress on POD activity in Camptotheca acuminata seedlings

2.2 對喜樹幼苗超氧化物歧化酶活性（SOD）的影響

SOD的主要功能是清除氧自由基，是防止其對細胞膜系統(tǒng)傷害的一種很重要的抗氧化酶。各處理導(dǎo)致喜樹幼苗內(nèi)SOD活性下降（見圖2）。在PEG處理中，SOD活性在12 h時已經(jīng)下降到32.7 U·mg-1，比對照低35.78%，隨后下降速度減緩，至60 h時SOD活性小幅上升，為29.8 U·mg-1，仍比對照低52.01%。在PEG＋ABA處理中，SOD活性呈下降趨勢，但下降幅度比PEG處理小，60 h時，SOD活性值為31.7 U·mg-1，較對照低42.90%，較PEG處理值高6.38%。在PEG＋氟啶酮處理中，SOD活性緩慢下降，12 h時比對照低14.41%，較PEG處理高16.21%，60 h時SOD活性略有上升。在滲透脅迫下，喜樹幼苗SOD活性不斷下降，在ABA被抑制后，喜樹幼苗內(nèi)SOD活性高于單純滲透脅迫下的水平，這說明ABA抑制劑的使用降低了SOD活性[15]，說明ABA與植物抗氧化酶活性有直接關(guān)系。

圖2 滲透脅迫對喜樹幼苗超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響Fig.2 Effect of osmotic stress on SOD activity in Camptotheca acuminata seedlings

2.3 對喜樹幼苗內(nèi)過氧化氫酶(CAT)活性的影響

CAT可把H2O2分解為H2O和O2，以清除H2O2的毒害作用。現(xiàn)在普遍認為植物受到環(huán)境脅迫后，保護酶活性下降。

圖3 滲透脅迫對喜樹幼苗內(nèi)過氧化氫酶（CAT）活性的影響Fig.3 Effect of osmotic stress on CAT activity in Camptotheca acuminata seedlings

各處理中喜樹幼苗內(nèi)CAT活性均降低（見圖3）。在PEG處理中，60 h時CAT降到最小值2.512 mg·g-1min-1，比對照低38.41%；在PEG＋ABA處理中，CAT活性在60 h時達到最小值2.645 mg·g-1min-1，較對照低31.46%，較PEG處理下最小值高5.29%；在PEG+氟啶酮處理中，CAT最小值2.953 mg·g-1min-1，比對照低17.74%，比PEG高17.56%。CAT活性在滲透脅迫下一直下降，ABA抑制劑可以抑制CAT活性下降。

2.4 對喜樹幼苗內(nèi)脫落酸（ABA）含量的影響

逆境條件可刺激ABA合成，尤其是干旱脅迫時更為顯著[16]。滲透脅迫下各處理ABA含量均高于對照（見圖4）。PEG處理使喜樹幼苗內(nèi)ABA含量大幅度上升，在12 h時，達到最大值1 832 ng·g-1，比對照高144.84%；在PEG＋ABA處理中，ABA的含量在12 h已經(jīng)上升到1 940 ng·g-1，在36 h時達到最大值2 319 ng·g-1，是對照的233.67%，比PEG處理同期高75.42%。在PEG+氟啶酮處理中，ABA的含量在12 h最高，比對照最大值高52.45%，較PEG處理的最大值低63.28%，較PEG+ABA處理最大值低106.68%。

2.5 對喜樹幼苗內(nèi)喜樹堿（CPT）含量的影響

各處理的喜樹堿含量變化不同（見圖5）。PEG處理的喜樹幼苗內(nèi)喜樹堿含量為0.120 9%，比對照高6.61%；在PEG＋ABA處理中，喜樹堿含量為0.114 4 %，略高于對照，但低于PEG處理；在PEG＋氟啶酮處理中，低于其它各處理，ABA抑制劑降低了喜樹堿的含量，這說明ABA對喜樹堿的合成存在一定的誘導(dǎo)作用。

圖4 滲透脅迫對喜樹幼苗內(nèi)脫落酸含量的影響Fig.4 Effect of osmotic stress on ABA content in Camptotheca acuminata seedlings

圖5 滲透脅迫對喜樹幼苗內(nèi)喜樹堿含量的影響Fig.5 Effect of osmotic stress on CPT content in Camptotheca acuminata seedlings

3 結(jié)論與討論

滲透脅迫下喜樹幼苗的各項抗氧化酶變化趨勢與其它植物相似[17-19]，滲透脅迫提高了保護性酶SOD、POD和CAT的活性，提高其抗旱性。

外源ABA及其合成抑制劑對滲透脅迫下喜樹幼苗的各項指標有較大的影響。滲透脅迫下施用外源ABA致使喜樹幼苗內(nèi)ABA含量劇烈上升，減少了滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累，減弱了滲透脅迫導(dǎo)致的抗氧化酶類活性的變化，減輕了滲透脅迫的作用效果。使用抑制劑氟啶酮抑制滲透脅迫下喜樹幼苗內(nèi)ABA生物合成后，可以降低抗氧化酶類活性的劇烈變化、減少內(nèi)源ABA的積累、減少喜樹堿因為滲透脅迫引起的積累。因此，ABA可以調(diào)控喜樹幼苗內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累和抗氧化酶類活性變化，可以誘導(dǎo)喜樹堿的生物合成。但是，ABA對喜樹堿的生物合成具有促進作用的含量閾值范圍以及ABA對喜樹堿生物合成過程中關(guān)鍵酶的影響還需要進一步的研究。

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