華仁杏SSR標(biāo)記的篩選與評(píng)價(jià)

秦 玥 ，劉夢(mèng)培 ，傅大立 ,2，朱高浦 ，趙 罕

（1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 經(jīng)濟(jì)林研究開(kāi)發(fā)中心，河南 鄭州 450003；2.北京林業(yè)大學(xué)，北京 100083）

華仁杏Armeniaca cathayanaD. L. Fuet al.屬于薔薇科Rosaceae李亞科Subfam. Prunoideae杏屬ArmeniacaScop.，是2010年傅大立等發(fā)表的我國(guó)杏屬一新種[1]。華仁杏是我國(guó)重要的木本糧食與油料兼用樹(shù)種，具有果核薄、杏仁大、無(wú)苦味、含油率高、油質(zhì)上乘、抗性強(qiáng)等優(yōu)良特性。華仁杏種質(zhì)資源豐富，栽培品種較多，但其相關(guān)的分子標(biāo)記研究鮮見(jiàn)報(bào)道，新種發(fā)表至今，僅有極少數(shù)學(xué)者就其不同品種與雜交種進(jìn)行了分子標(biāo)記研究[2-5]。

研究華仁杏的SSR引物，對(duì)尋求科學(xué)準(zhǔn)確的種質(zhì)鑒定技術(shù)，解決其生產(chǎn)中存在的品種混雜、同名異物現(xiàn)象具有重要意義。SSR分子標(biāo)記是近幾年發(fā)展起來(lái)的利用范圍較廣的分子標(biāo)記技術(shù)，具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、共顯性遺傳、數(shù)量豐富、對(duì)基因組覆蓋性高等優(yōu)勢(shì)[6-8]。目前，SSR分子標(biāo)記技術(shù)以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)在遺傳多樣性分析[9-10]、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建[11-12]、基因定位[13]等研究中均發(fā)揮了重要作用。由于華仁杏為近年發(fā)現(xiàn)的新種，目前適用于華仁杏研究的SSR引物未見(jiàn)報(bào)道，無(wú)法滿足其品種鑒別和起源演化等研究的需要，因此，加快開(kāi)發(fā)華仁杏SSR引物篩選工作顯得尤為重要。關(guān)于其它物種的研究表明[14-16]，SSR分子標(biāo)記在屬內(nèi)不同種間具有一定的通用性，甚至在不同屬間也具有一定的通用性。因此對(duì)近緣物種已開(kāi)發(fā)的SSR引物進(jìn)行篩選，也是一條獲取SSR引物的重要途徑。

本研究中利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，以華仁杏為供試材料，篩選適合的多態(tài)性引物，旨在為華仁杏遺傳資源的進(jìn)一步評(píng)價(jià)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試華仁杏材料均采集于中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院張家口實(shí)驗(yàn)基地，共60份（見(jiàn)表1）。SSR引物均由上海英俊公司合成，試驗(yàn)中所用試劑均購(gòu)于Takara公司。

表1 供試的華仁杏品種Table 1 The tested cultivars of Armeniaca cathayana

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取

取60份華仁杏幼嫩健康的葉片，利用試劑盒法提取基因組DNA，并用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其質(zhì)量和濃度。

1.2.2 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系總體積20 μL，其中Premix Taq Version 2.0（Loading dye mix） 9 μL，上下游引物各1 μL（10 μmoL/L）、DNA模板1.5 μL（20 mg/L），ddH2O 7.5 μL。循環(huán)體系 94 ℃預(yù)變性 4 min，94 ℃變性40 s，53 ℃退火40 s，72 ℃延伸80 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.3 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)

擴(kuò)增產(chǎn)物在110 V電壓下，利用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，40 min后取出在全自動(dòng)紫外與可見(jiàn)分析裝置中拍照。

具有清晰條帶的產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺凝膠（PAG）上電泳，200 V電壓，電泳2 h后，將膠取出放入之前配置好的染色液中染色。染色液的配制方法：10 mL 1 moL/L 的NaCl溶液中加入10 μL的10 000×Gelred原液，再用1×TBE定容到100 mL）。30 min后取出拍照[17]。

1.2.4 數(shù)據(jù)采集與統(tǒng)計(jì)分析

將電泳圖譜上同一位置清晰出現(xiàn)的條帶記為1，沒(méi)有條帶記為0，記錄過(guò)程中，統(tǒng)計(jì)主要帶型，忽略弱雜帶型，構(gòu)建SSR引物擴(kuò)增結(jié)果的數(shù)據(jù)庫(kù)。統(tǒng)計(jì)每對(duì)SSR引物PCR擴(kuò)增出的不同等位位點(diǎn)數(shù)，計(jì)算每個(gè)SSR位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量指數(shù)（PIC），，其中Pi為某個(gè)SSR位點(diǎn)的第i個(gè)等位變異出現(xiàn)頻率占該位點(diǎn)全部等位變異出現(xiàn)頻率的比率。并用PopGene軟件計(jì)算雜合度、Shannon指數(shù)等信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物篩選結(jié)果

利用8份華仁杏樣品進(jìn)行65對(duì)李亞科SSR引物的篩選，其中31對(duì)引物多態(tài)性較高、穩(wěn)定性較好并且分辨率較高。利用這31對(duì)SSR引物對(duì)60份華仁杏材料進(jìn)行擴(kuò)增，得到產(chǎn)物片段大小在67～394 bp之間，部分電泳結(jié)果如圖1與圖2所示，篩選出的31對(duì)引物的信息見(jiàn)表2。

2.2 引物SSR位點(diǎn)分析

利用篩選出的31對(duì)SSR引物在60個(gè)華仁杏樣品中檢測(cè)到138個(gè)等位基因位點(diǎn)，每對(duì)引物可檢測(cè)2～7個(gè)等位位點(diǎn)，平均等位位點(diǎn)數(shù)為4.5個(gè)。其中，以引物aprigms20、aprigms24和BPPCT030檢測(cè)的等位基因最多。平均多態(tài)性信息含量指數(shù)（PIC）為0.72，變化范圍為0.28～0.90，以引物aprigms18的值最高，引物Pchgms2的值最低。

利用PopGene軟件分析31對(duì)引物對(duì)60份華仁杏材料的檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可以看出：平均觀測(cè)雜合度為0.533 6；引物BPPCT002的值最高，為0.867 9；引物Pchgms2的最低，為0.050 0。平均期望雜合度為0.580 8；引物BPPCT030的值最高，為0.785 9；引物Pchgms2的最低，為0.065 4。Nei指數(shù)（h）的分布范圍在0.064 9～0.779 1之間，平均每個(gè)位點(diǎn)的h值為0.575 4。平均每個(gè)位點(diǎn)的Shannon信息指數(shù)（I）值為0.646 5；引物BPPCT030的I值最高，為1.674 6；引物Pchgms2的值最低，為0.164 9。

圖1 引物BPPCT030的部分?jǐn)U增產(chǎn)物的6%聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig.1 6% PAGE gel electrophoresis of part of ampli fied products with primer BPPCT030

圖2 引物Pchgms2的部分?jǐn)U增產(chǎn)物的6%聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig.2 6% PAGE gel electrophoresis of part of ampli fied products with primer Pchgms2

表2 篩選出的31對(duì)SSR引物對(duì)60份供試材料的擴(kuò)增結(jié)果Table 2 Amplification result of 60 samples by using 31 pairs of primers

表3 華仁杏引物的SSR擴(kuò)增統(tǒng)計(jì)結(jié)果和基因多樣性分析Table 3 SSR amplification results of primers and analysis of genetic diversity in Armeniaca cathayana

3 討論與結(jié)論

本研究以華仁杏不同品種作為試驗(yàn)材料，從65對(duì)已公開(kāi)發(fā)表的SSR引物中篩選出31對(duì)引物，可以擴(kuò)增出清晰的條帶。該31對(duì)引物中既包括杏屬引物，也包括李屬及少量其它薔薇科引物，由此可見(jiàn)，SSR標(biāo)記具有較好的通用性。

利用31對(duì)引物在60份華仁杏材料中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共檢測(cè)到138個(gè)等位基因位點(diǎn)，每對(duì)引物可檢測(cè)2～7個(gè)等位位點(diǎn)，其中有3對(duì)引物等位位點(diǎn)數(shù)達(dá)到7。較高的多態(tài)性顯示了SSR標(biāo)記具有較高的應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)也反映了供試材料在該位點(diǎn)存在較大的遺傳差異[18]。

PIC值、雜合度、Nei’s基因多樣性、Shannon信息指數(shù)均是描述引物多態(tài)性的指標(biāo)。計(jì)算每對(duì)引物的PIC值，最高可達(dá)0.9，平均值也高達(dá)0.72，較玉米[19]、辣椒[20]、甜瓜[21]等其它多數(shù)物種偏高。一般認(rèn)為當(dāng)PIC＞0.5時(shí)，該引物為高度多態(tài)性信息引物；當(dāng)0.25＜PIC＜0.5時(shí)，為中度多態(tài)性信息引物；當(dāng)PIC＜0.25時(shí)，為低度多態(tài)性信息引物[22]。本研究中所得平均期望雜合度及觀測(cè)雜合度分別為0.533 6及0.580 8，較Fatemeh等[23]和張淑青等[24]試驗(yàn)所得值0.628和0.68偏低。

綜合幾個(gè)指標(biāo)，31對(duì)引物中鑒別能力最強(qiáng)的2對(duì)引物為BPPCT030和aprigms18，最弱的2對(duì)引物為Pchgms2和aprigms23。

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