生物鐘基因與哺乳動物生殖

李瑞文，成姝婷，王正榮

(1.四川大學華西基礎(chǔ)醫(yī)學與法醫(yī)學院，成都610041;2.成都市婦女兒童中心醫(yī)院生殖與內(nèi)分泌實驗室，成都610091)

生物節(jié)律是指生物為了適應環(huán)境，在整個生命過程中，從分子、細胞到機體、群體各個層次上都有明顯的時間周期現(xiàn)象，按照周期的長短分為:“短日節(jié)律(ultradian rhythm)，長日節(jié)律(infradian rhythm)，近周節(jié)律(circaseptan rhythm)，近月節(jié)律(circamensual rhythm)和近年節(jié)律(circannual rhythm)等”。其中近日節(jié)律是生物節(jié)律中最重要的一種，從單細胞生物到人，幾乎存在于所有生物體內(nèi)部。近日節(jié)律主要受生物鐘基因的調(diào)控，因此，運用現(xiàn)代時間生物學理論及其研究方法來研究生殖疾病是當前的前言熱點問題。

1 近日節(jié)律與生物鐘基因

近日節(jié)律又叫晝夜節(jié)律，是一種以近似24 h為周期的自主維持的振蕩器，在自由運轉(zhuǎn)的情況下，這種節(jié)律仍然存在。這種近日節(jié)律系統(tǒng)主要包括輸入機制、內(nèi)在的生物鐘和輸出機制3種。晝夜節(jié)律與基因的節(jié)奏性表達有關(guān)，這些基因常受生物鐘調(diào)節(jié)，基因表達量伴隨晝夜循環(huán)發(fā)生規(guī)律性變化。我們把對維持生物體節(jié)律起關(guān)鍵性作用的晝夜節(jié)律基因稱為生物鐘基因(clock genes)，其蛋白表達產(chǎn)物稱為鐘蛋白;處于鐘基因下游，受晝夜節(jié)律輸出信號調(diào)控的一系列基因稱為鐘控基因(clock controlled genes，CCGS)［1］。目前哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)至少10種以上的生物鐘基因，下面介紹幾種主要的生物鐘基因，及其對近日節(jié)律的調(diào)節(jié)。

Clock基因是King等1997年通過定位克隆策略發(fā)現(xiàn)的，是哺乳動物中最早被鑒定的生物鐘基因。該研究小組發(fā)現(xiàn)單個堿基的突變可以導致生物節(jié)律的消失，他們把這種突變稱之為Circadian Locomotor Output Cycles Kaput，即晝夜節(jié)律運輸出周期故障，首字母縮寫為 CLOCK，故命名為時鐘(Clock)基因［2］。Clock基因在節(jié)日節(jié)律中起核心作用，小鼠Clock基因的表達為組成型，其產(chǎn)物 CLOCK蛋白是一種轉(zhuǎn)錄因子，屬于bHLH/PAS(堿性螺旋一環(huán)一螺旋/PAS)家族。研究發(fā)現(xiàn)，CLOCK蛋白主要是與具有BHLH/PAS轉(zhuǎn)錄因子家族成員的腦和肌肉組織芳香羥受體核轉(zhuǎn)運蛋白的類似蛋白-1(Brain and Muscle Amt Like protein，BMAL1)形成異二聚體，再進而連接到下游靶基因啟動子的E.box元件上，調(diào)控后者表達。Vitaterna和Shearman等在研究發(fā)現(xiàn)，Clock突變型小鼠的行為節(jié)律出現(xiàn)異常，其純合子小鼠在持續(xù)黑暗中逐漸出現(xiàn)近日節(jié)律異常［3，4］。周期基因 period 最早在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，Konopka和Benzer［5］1971年在果蠅中發(fā)現(xiàn)單個基因突變能影響果蠅的晝夜節(jié)律，并把該基因定義為period，該基因的發(fā)現(xiàn)開創(chuàng)了鐘基因時代。在1997年的哺乳動物中也克隆得到了該基因(小鼠為mPer，人為hPer)，小鼠研究表明，該基因存在Per1，Per2和Per3三種亞型。研究表明mPer1，mPer2和mPer3這三種亞型在表達上具有組織和時間特異性，推測這幾個基因在哺乳動物日節(jié)律中的功能也不同。mPer1、mPer2突變或缺失的大鼠，可以引起晝夜節(jié)律的變化，比如mPerl突變小鼠，雖然體外mPer2，mCryl和Bmal1基因的表達水平?jīng)]有改變，但小鼠的活動周期變短了;mPer2突變則可使mPerl和mCryl表達下降，以及Bmal1表達峰的偏移，進而導致小鼠晝夜活動能力逐漸消失，且mPer1和mPer2雙突變的小鼠，在連續(xù)黑暗條件下行為節(jié)律立即消失;但Per3缺陷的小鼠并不影響其他生物節(jié)律基因的表達，近日節(jié)律依然存在，mPer3基因?qū)円构?jié)律也許是非必需的。

Bmal1又叫MOP3，烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白ARNTL(Aryl hydrocarbon receptor nucleartranslocator-like)，JAP3，TIC和ARNTL3等，是哺乳動物生物鐘轉(zhuǎn)錄、翻譯反饋環(huán)中的核心成分，以異源二聚體的形式在反饋環(huán)中發(fā)揮重要的正調(diào)節(jié)作用。該基因是Ikeda和Nomura在1997年人的基因組中已得到體外表達的小段序列中，發(fā)現(xiàn)了一種新的含 PAS結(jié)構(gòu)域(Per，ARNK，ARH，sim domain)的基因序列并成功克隆，該序列被命為Bmal1。Bmall基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物是轉(zhuǎn)錄因子BMAL1，具有堿性螺旋一環(huán)一螺旋(bHLH)一PAS結(jié)構(gòu)域。同時有報道指出，BMAL1其不僅僅作為CLOCK的二聚體發(fā)揮作用，當mBmal1基因缺失時，小鼠活動節(jié)律立即紊亂［6］，說明了其本身也可在生物節(jié)律中單獨發(fā)揮作用。而且，BMAL1還可以與NPAS2(Neuronal PAS domain protein 2)形成異源二聚體來激活某些生物鐘基因的表達在端腦部位發(fā)揮作用［7，8］。

隱花色素基因(Cryptochrom，Cry)是一個光受體，該基因是在研究哺乳動物DNA修復光解酶過程中發(fā)現(xiàn)的，屬于植物藍光受體基因家族和光解酶家族成員，是反饋環(huán)唯一的負調(diào)節(jié)因子，在生物節(jié)律中具有重要的作用。最初認為只有高等真核細胞中才有CRY，原核細胞中只有光解酶而沒有CRY，但是進一步研究顯示，藍細菌(Synechocystis)中也有CRY，這種新型的CRY被稱CRY-DASH［9］。因此CRY在進化上被分為植物CRY、動物CRY和CRY-DASH蛋白三類。目前，在昆蟲、魚類、兩棲類和哺乳類中都發(fā)現(xiàn)CRY的存在［10，11］。研究表明，不同物種其 Cry基因的亞型不同，昆蟲Cry基因包括Cry1和Cry2，果蠅只有Cry1，蜜蜂等膜翅昆蟲只有Cry2。小鼠有兩個Cry基因(mCryl，mCry2)，但在SCN中，只有mCryl基因RNA呈現(xiàn)節(jié)律性表達［12］。mCry2突變將引起自由運動周期延長1 h，而mCryl突變體則表現(xiàn)出相反的表型，如果是兩種亞型均發(fā)生突變，則生物鐘基因Per的節(jié)律性喪失，生物節(jié)律完全紊亂［13］。

2 生物鐘基因在哺乳動物生殖中的作用

生物鐘基因的中樞系統(tǒng)在非哺乳類脊椎動物位于松果體(pineal gland，PG)，在哺乳動物位于下丘腦視交叉上核(suprachiasmatic nuclei，SCN)。隨著研究的不斷深入，學者們發(fā)現(xiàn)，這些生物鐘基因不僅僅在中樞系統(tǒng)表達，在其他外周組織也存在表達［14-16］，暗示著生物鐘基因不僅僅在生物節(jié)律中發(fā)揮作用，在機體其他代謝中也發(fā)揮著重要作用。研究表明，Clock基因存在著基因多態(tài)性，這種多態(tài)性與睡眠障礙，乳腺癌，DSPS，免疫系統(tǒng)和精液遺傳變異等多種疾病相關(guān)［17，18］。研究指出成年Bmal1突變小鼠還出現(xiàn)強烈的體脂減少，比如40周齡的野生型雄鼠腹部脂肪可達1.5 g，而突變的小鼠腹部脂肪只有70 mg，說明Bmal1控制著細胞中脂肪的沉積，并對脂肪細胞分化具有促進作用［19，20］。Takarada 等指出，Bmal1 在年輕小鼠的軟骨組織中表達［21］，Paschos等指出在脂肪細胞中特異的敲除Bmal1基因會引起肥胖［22］。Pappa等指出，Bmal1與妊娠糖尿病發(fā)生相關(guān)，但Clock，Per1，Per2，Cry1等生物鐘基因卻不存在改變［23］。Relles等指出生物鐘基因Per2，Clock和Bmal1在胰腺癌中的表達與病理相關(guān)，而 Cry1基因表達則無相關(guān)性［24］。Milagro等指出Clock，Per2和Bmal的甲基化與肥胖和代謝疾病相關(guān)［20］。有報道指出Per2與神經(jīng)膠質(zhì)瘤，乳腺癌，結(jié)腸癌，，胰腺癌 有關(guān)［25，26］。但關(guān)于上述基因在人類胎兒流產(chǎn)中是否存在作用，尚未見報道。

近幾年研究表明，生物鐘基因在哺乳動物的卵巢，輸卵管和子宮等生殖器官中均存在表達，指出生物鐘基因與哺乳動物生殖相關(guān)。Johnson等指出，生物鐘基因在早期懷孕小鼠的生殖系統(tǒng)和孕體中存在表達［27］，Kennaway等指出生物鐘及鐘控基因 Per1，Per2和Bmal1在大鼠的輸卵管中呈節(jié)律性的表達［28］，Shimizu等指出生物鐘基因Bmal1，Cry和Per2在牛的卵巢發(fā)育中不受卵泡刺激素的影響，但Clock與卵泡發(fā)育相關(guān)［16］。Ratajczak等指出，生物鐘基因 Bmal1，Clock，Cry1/2和Per1/2在小鼠晚期懷孕的子宮，胎盤和胎膜等組織中均存在表達，提示我們這些生物鐘基因與懷孕分娩相關(guān)［29］。關(guān)于其在精子方面的研究，Alvarez等［30］指出，近日節(jié)律基因 Clock、Per1、Per2、Bmal1 和Cry1限制性表達在睪丸精子生成過程中不同的細胞類型。對Clock突變的小鼠Per1表達水平并未降低，這更進一步說明了在睪丸Clock、Bmal1可能表達在精子生成過程中不同的細胞類型，Clock、Bmal1并未形成異二聚體聚合在細胞核內(nèi)參與驅(qū)動轉(zhuǎn)錄的過程，且Clock在精子生精過程中圓形精子的頂體具有明顯的表達。Morse等［31］指出在生物鐘基因Per1或Bmal1在小鼠睪丸未檢測到表達，Per1 mRNA在精子發(fā)育的精原細胞和精母細胞階段存在表達。Bittman等［32］也指出，Per1在曲細精管表達，但Per2 mRNA卻沒有在任何結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)。其它研究也表明，精子發(fā)育不需要近日節(jié)律振蕩器。盡管分子鐘對精子發(fā)育、精子活力和受精能力無作用，但對睪丸雄激素的合成起重要作用。研究指出ClockΔ19突變的雄性小鼠睪丸質(zhì)量正常、精子計數(shù)、精子活力等沒有明顯改變，但突變小鼠引起雌鼠的胎仔數(shù)減少［33，34］，ClockΔ19突變的雌鼠出現(xiàn)排卵程序紊亂，從而造成排卵功能障礙，并且流產(chǎn)、胎兒和胚胎的再吸收情況比例增高，仔鼠的存活率降低［35］。同時有研究表明，Bmal1基因也對哺乳動物生殖有重要影響，如Kennaway等［36］指出Bmal1敲除的雄性小鼠，其精子異常發(fā)生率增高，并且很難與正常雌性小鼠卵母細胞成功受精(約占7%);Alvarez等［37］指出敲除 Bmal1基因純合子(Bmal1-/-)小鼠，盡管顯示正常的精子活力和受精能力，但精子數(shù)量顯著減少。除了在小鼠上的報道之外，有學者指出Per基因在昆蟲精子能量釋放中存在重要的調(diào)控作用［38］。本實驗室在研究中發(fā)現(xiàn)，干擾Clock生物鐘基因后，小鼠死胎和異常發(fā)育的胎鼠增多，推測Clock基因與胎兒流產(chǎn)相關(guān)，但包括Clock在內(nèi)的生物鐘基因是否與人類胎兒流產(chǎn)相關(guān)，其在人類胎兒發(fā)育過程中的表達規(guī)律如何，這些目前尚未見報道，需要進行大量深入的研究工作來進行證明。

3 結(jié)語

總之，生物鐘基因在哺乳動物生殖中具有重要的調(diào)控作用，但是目前為止，尚有很多問題沒有研究清楚，在睪丸，卵巢和流產(chǎn)中的作用機制都沒有闡明，需要進一步進行研究，而且采集人的樣品有很多限制因素，也限制了研究的進展。我們相信，隨著對Clock，Bmal1，Per，Cry等生物鐘基因的深入研究，隨著現(xiàn)代分子生物學和遺傳學的發(fā)展，關(guān)于這些生物鐘基因在哺乳動物生殖中的作用將會更加明確。探索生物鐘基因的表達與人胎兒流產(chǎn)的關(guān)系，及可能作用的機制，可以為胎兒流產(chǎn)等生殖疾病的研究提供理論依據(jù)，為解決人類生殖方面的研究提供新的思路和手段。

［1］李 然，彭小忠，曹濟民.哺乳動物日節(jié)律基因表達調(diào)控研究進展［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學與臨床，2005，25(7):587-593.

［2］King D P，Zhao Y，Sangoram A M，et al.Positional cloning of the mouse circadian clock gene［J］.Cell，1997，89(4):641-653.

［3］Vitaterna M H，King D P，Chang A M，et al.Mutagenesis and mapping of a mouse gene，clock，essential for circadian behavior［J］.Science，1994，264(5159):719-725.

［4］Shearman L P，Sriram S，Weaver D R，et al.Interacting molecular loops in the mammalian circadian clock ［J］.Science，2000，288(5468):1013-1019.

［5］Konopka R J ，Benzer S.Clock mutants of Drosophila melanogaster［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1971，68(9):2112-2116.

［6］Bunger M K，Wilsbacher L D，Moran S M，et al.Mop3 is an essential component of the master circadian pacemaker in mammals［J］.Cell，2000，103(7):1009-1017.

［7］Reick M，Garcia J A，Dudley C，et al.NPAS2:an analog of clock operative in the mammalian forebrain［J］.Science，2001，293(5529):506-509.

［8］Mongrain V，La Spada F，Curie T，et al.Sleep loss reduces the DNA-binding of BMAL1，clock，and NPAS2 to specific clock genes in the mouse cerebral cortex［J］.PLoS One，2011，6(10):e26622.

［9］Brudler R，Hitomi K，Daiyasu H ，et al.Identification of a new cryptochrome class，structure，function，and evolution ［J］.Mol Cell，2003，11(1):59-67.

［10］Li Y Y，Mao K，Zhao C，et al.Molecular cloning and functional analysis of a blue light receptor gene MdCRY2 from apple(Malus domestica)［J］.Plant Cell Rep，2013，［Epub ahead of print］

［11］Del Pozo A，Vera L M，Sánchez J A，et al.Molecular cloning，tissue distribution and daily expression of cry1 and cry2 clock genes in European seabass(Dicentrarchus labrax)［J］.Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol，2012，163(3-4):364-71.

［12］Kume K，Zylka M J，Sriram S，et al.mCRY1 and mCRY2 are essential components of the negative limb of the circadian clock feedback loop［J］.Cell，1999，98(2):193-205.

［13］Vitaterna M H，Selby C P，Todo T，et al.Differential regulation of mammalian period genes and circadian rhythmicity by cryptochromes，1 and 2［J］.Proc Nat1 Acad Sci USA，1999，96:12114-12119.

［14］Watanabe M，Hida A，Kitamura S，et al.Rhythmic expression of circadian clock genes in human leukocytes and beard hair follicle cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2012，425(4):902-907.

［15］Mazzoccoli G，F(xiàn)rancavilla M，Giuliani F，et al.Clock gene expression in mouse kidney and testis:analysis of periodical and dynamical patterns［J］.J Biol Regul Homeost Agents，2012，26(2):303-311.

［16］Shimizu T，Hirai Y ，Murayama C，et al.Expressions of the circadian genes Per2，Bmal1，clock and Cry1 during the different stages of follicular development and their regulation by FSH in bovine granulosa cells from small follicles［J］.Livest Sci，2012 ，145(1):292-297.

［17］Zhang J，Ding X，Li Y，et al.Association of clock gene variants with semen quality in idiopathic infertile Han-Chinese males［J］.Reprod Biomed Online，2012 ，25(5):536-542.

［18］Spengler M L，Kuropatwinski K K，Comas M，et al.Core circadian protein clock is a positive regulator of NF-κB-mediated transcription［J］.Proc Natl Acad Sci，2012，109(37):E2457-2465.

［19］Paschos G K，Ibrahim S，Song W L，et al.Obesity in mice with adipocyte-specific deletion of clock component Arntl［J］.Nat Med，2012，8(12):1768-1777.

［20］Milagro F I，Gómez-Abellán P，Campión J，et al.CLOCK，PER2 and BMAL1 DNA methylation:association with obesity and metabolic syndrome characteristics and monounsaturated fat intake［J］.Chronobiol Int，2012，9(9):1180-1194.

［21］Takarada T，Kodama A，Hotta S，et al.Clock genes influence gene expression in growth plate and endochondral ossification in mice［J］.J Biol Chem，2012，287(43):36081-36095.

［22］Paschos G K，Ibrahim S，Song W L，et al.Obesity in mice with adipocyte-specific deletion of clock component Arntl［J］.Nat Med，2012，18(12):1768-1777.

［23］Pappa K I，Gazouli M，Anastasiou E，et al.Circadian clock gene expression is impaired in gestational diabetes mellitus［J］.Gynecol Endocrinol，2013，［Epub ahead of print］

［24］Relles D，Sendecki J，Chipitsyna G，et al.Circadian gene expression and clinicopathologic correlates in pancreatic cancer［J］.J Gastrointest Surg，2013，17(3):443-450.

［25］Chen S T，Choo K B，Hou M F，et al.Deregulated expression of the PER1，PER2 and PER3 genes in breast cancers［J］.Carcinogenesis，2005，26(7):1241-1246.

［26］Xia H C，Niu Z F，Ma H，et al.Deregulated expression of the Per1 and Per2 in human gliomas［J］.Can J Neurol Sci，2010，37(3):365-370.

［27］Johnson M H，Lin A，F(xiàn)ernando D，et al.Circadian clock work genes are expressed in the reproductive tract and conceptus of the early pregnant mouse［J］.Reprod Biomed Online，2002，4(2):140-145.

［28］Kennaway D，Varcoe J，Mau V.Rhythmic expression of clock and clock-controlled genes in the rat oviduct［J］.Mol Hum Reprod，2003，9(9):503-507.

［29］Ratajczak C K，Herzog E D，Muglia L J.Clock gene expression in gravid uterus and extra-embryonic tissues during late gestation in the mouse［J］.Reprod Fertil Dev，2010，22(5):743-750.

［30］Alvarez J，Chen D，Storer E，et al.Non-cyclic and developmental stage-specific expression of circadian clock proteins during murine spermatogenesis［J］.Biol Reprod，2003，69(1):81-91.

［31］Morse D，Cermakian N，Brancorsini S，et al.No circadian rhythms in testis:period1expression is clock independent and developmentally regulated in the mouse［J］.Mol Endocrinol，2003，17(1):141.

［32］Bittman E L，Doherty L，Huang L，et al.Period gene expression in mouse endocrine tissues［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2003，285(3):561-569.

［33］Beaver L M，Gvakharia B O，Vollintine T S，et al.Loss of circadian clock function decreases reproductive fitness in males of Drosophila melanogaster［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(4):2134-2139.

［34］Dolatshad H，Campbell E A，O'Hara L，et al.Developmental and reproductive performance in circadian mutant mice［J］.Hum Reprod，2006，21(1):68-79.

［35］Miller B H，Olson S L，Turek F W，et al.Circadian clock mutation disrupts estrous cyclicity and maintenance of pregnancy［J］.Current Biology，2004，14(15):1367-1373.

［36］Kennaway D.The role of circadian rhythmicity in reproduction［J］.Human Reproduction Update，2004，11(1):91-101.

［37］Alvarez J D，Hansen A，Ord T，et al.The circadian clock protein BMAL1 is necessary for fertility and proper testosterone production in mice［J］.J Biol Rhythms，2008，23(1):26-36.

［38］Kotwica J，Bebas P，Gvakharia B O，et al.RNA interference of the period gene affects the rhythm of sperm release in moths［J］.J Biol Rhythms，2009，24(1):25-34.