登革病毒檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

吳忠華，羅鵬，徐琦，何蕾，呂沁風(fēng)

浙江國際旅行衛(wèi)生保健中心，浙江 杭州 310003

登革病毒（dengue virus，DENV）感染是人類最常見的蟲媒傳播病毒病，據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，目前世界上約有25億人口有感染DENV的風(fēng)險(xiǎn)，居住在熱帶和亞熱帶地區(qū)的人群風(fēng)險(xiǎn)較高，全世界每年約有5000萬～1億的DENV新感染者出現(xiàn)[1]。

DENV屬于黃病毒科黃病毒屬，來源不明，是有包膜的單鏈RNA病毒，基因組全長約11 kb，編碼核衣殼蛋白（C蛋白）、膜蛋白（M蛋白）、包膜蛋白（E蛋白）這3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（NS蛋白），通常通過埃及伊蚊和白紋伊蚊傳播，有4種抗原性不同的血清亞型，不同亞型的序列有65%～70%的同源性[2]。任何一種亞型都能引起登革熱（dengue fever，DF）、登革出血熱（dengue hemorrhagic fever，DHF）和登革休克綜合征（dengue shock syndrome，DSS）。大多數(shù)感染者無臨床癥狀，只有小部分會(huì)出現(xiàn)有癥狀感染，其中最常見的是DF，其臨床表現(xiàn)與感冒引發(fā)的急性高熱相似；嚴(yán)重的會(huì)有DHF，癥狀包括高熱、低血小板計(jì)數(shù)、出血和血管通透性增加；最嚴(yán)重的是以循環(huán)衰竭為特征、危及生命的DSS。DHF和DSS是DENV能引發(fā)的最嚴(yán)重癥狀，且在兒童和15歲以下青少年中更為常見。目前仍無針對(duì)DENV的有效疫苗上市，但早期發(fā)現(xiàn)和治療干預(yù)可降低其致死性，因此DENV檢測(cè)技術(shù)的研究對(duì)早期診斷治療、降低致死率具有極其重要的意義。

1 DENV的分離培養(yǎng)法

DENV血癥可在發(fā)熱前2～3 d至初次感染開始后5 d或再次感染后4 d內(nèi)檢出[3]，這段時(shí)間內(nèi)患者的外周血、血清或血漿樣本都可分離出病毒。常用分離方法有敏感細(xì)胞培養(yǎng)分離、成年蚊蟲胸腔接種分離和乳鼠腦內(nèi)接種分離。

1.1 蚊蟲胸腔內(nèi)接種

蚊蟲胸腔內(nèi)接種是敏感性最高的病毒分離方法，4種血清型DENV的分離率為71.5%～84.2%[4]。病程早期（前4 d）的樣本接種可獲得更高的分離率（85.3%），4 d后分離率為65.4%[4]，且初次感染病人的病毒分離率（91.0%）高于再次感染者（77.6%）[3]。

1.2 乳鼠腦內(nèi)接種

出生2～4 d乳鼠腦內(nèi)注射病人血清或血漿樣本，每日觀察，在死前取腦分離DENV[5]。

1.3 敏感細(xì)胞系培養(yǎng)分離

蚊蟲和乳鼠腦內(nèi)接種分離病毒對(duì)技術(shù)、安全性和可行性要求高，花費(fèi)也高，故敏感細(xì)胞系培養(yǎng)分離更加常用。常用的敏感細(xì)胞包括蚊蟲傳代細(xì)胞系，如白紋伊蚊細(xì)胞C6/36、偽盾伊蚊細(xì)胞AP-61、安波巨蚊細(xì)胞Tra-284、CLA-1蚊蟲細(xì)胞，或哺乳動(dòng)物細(xì)胞 LLC-MKZ、幼倉鼠腎細(xì)胞 BHK21、Vero細(xì)胞、Ve?ro-E6細(xì)胞等。細(xì)胞培養(yǎng)分離法的靈敏度只有約40.5%[6]，且有少數(shù)毒株可能不引起細(xì)胞病變，此類病例不能通過細(xì)胞接種的方法檢出。

除直接用于診斷外，病毒分離法還為體外實(shí)驗(yàn)如基因測(cè)序、病毒中和及感染實(shí)驗(yàn)提供病毒。病毒分離法診斷DENV的優(yōu)點(diǎn)是可靠，適用于感染早期的疾病監(jiān)測(cè)，缺點(diǎn)是耗時(shí)較長。因此，病毒分離法目前已極少用于臨床診斷。

2 DENV的血清學(xué)檢測(cè)方法

感染DENV后的急性期后期，血清學(xué)檢測(cè)是較好的方法。DENV的常用血清學(xué)檢測(cè)方法包括血凝抑制試驗(yàn)（hemagglutination inhibition，HI）、空斑減少中和試驗(yàn)（plaque reduction neutralization test，PRNT）、間接免疫熒光抗體試驗(yàn)（indirect immunoflu?orescence assay，IFA）、IgM/IgG捕獲ELISA法、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（dot immune-binding as?say，DIBA）、免疫印跡和快速層析法。

2.1 血凝抑制試驗(yàn)

血凝抑制試驗(yàn)敏感性高，重復(fù)性好，操作簡便，檢出率高于病毒分離法，曾是DENV血清學(xué)檢驗(yàn)的金標(biāo)準(zhǔn)。此法的優(yōu)點(diǎn)是試驗(yàn)所需試劑配制方便，可根據(jù)血清滴度的不同判斷初次感染或二次感染，HI滴度≥1∶2560則為二次感染，＜1∶2560則為初次感染。血凝抑制試驗(yàn)也有諸多缺點(diǎn)：①待檢測(cè)的血清樣本必須先經(jīng)預(yù)處理，以去除紅細(xì)胞凝集的非特異性抑制劑；②準(zhǔn)確的HI測(cè)試需要急性期和恢復(fù)期的血清樣本，急性期和恢復(fù)期血清樣本的滴度相差4倍或以上才能確診近期感染；③方法缺少特異性，不能區(qū)別DENV感染和其他相近種類的病毒感染，如乙型腦炎病毒、西尼羅河病毒感染，因此在其他黃病毒感染也高發(fā)的地區(qū)使用受限；④易發(fā)生交叉反應(yīng)且不能區(qū)分DENV的血清型。因此，血凝抑制試驗(yàn)現(xiàn)已逐漸被其他更加快速準(zhǔn)確的方法所取代。

2.2 空斑減少中和試驗(yàn)

空斑減少中和試驗(yàn)可用于檢測(cè)感染過DENV的患者的血清分型?；痉椒ㄊ窃诓煌♂屄实牟∪搜逯屑尤攵康牟《荆臃N到預(yù)先準(zhǔn)備好的單層細(xì)胞中培養(yǎng)數(shù)天，統(tǒng)計(jì)蝕斑數(shù)，計(jì)算該血清的蝕斑中和效價(jià)。最終滴度是使蝕斑減少50%～90%的血清的最高稀釋率。DENV初次感染者的血清能使蝕斑數(shù)減少90%[7]。二次感染和抗體依賴性增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)中，PRNT試驗(yàn)陽性反應(yīng)中蝕斑減少50%～70%[8]。PRNT是鑒別不同種類黃病毒的血清學(xué)檢查金標(biāo)準(zhǔn)[9-10]。傳統(tǒng)PRNT法的缺點(diǎn)是耗時(shí)較長，需要活病毒，對(duì)操作人員技術(shù)要求高，且不能用于大量臨床或流行病學(xué)樣本的高通量分析。目前已有基于PRNT的改良法，使用偽病毒報(bào)告顆?？捎行z測(cè)DENV的4種血清型[11]。

2.3 IgM/IgG捕獲ELISA法

此法的基本過程是以人抗IgM或IgG包被酶標(biāo)板，病毒抗體、病毒抗原、二抗和酶按順序相互結(jié)合孵育，最后用分光光度計(jì)檢測(cè)顯色程度代表不同滴度。鼠腦來源的病毒血凝素抗原或細(xì)胞來源的病毒抗原都可作為病毒抗原使用，兩者的敏感性和特異性并無顯著差異[12-13]。目前IgM/IgG捕獲ELISA法是判斷初次感染和再次感染的常用指標(biāo)[14]。

目前已有多種商品化ELISA試劑盒可用于DENV抗體檢測(cè)，特異性和敏感性也很不錯(cuò)。ELISA法的優(yōu)點(diǎn)是操作方便迅速，IgM-ELISA可檢測(cè)出近期感染，IgM與IgG的吸光度比值可鑒別是初次還是二次感染。但ELISA法有2個(gè)缺點(diǎn)，一是血清中的風(fēng)濕因子會(huì)影響DENV IgM的檢測(cè)特異性[15]，二是ELISA法用全部病毒抗原來檢測(cè)登革特異性抗體，4個(gè)血清型之間易產(chǎn)生交叉反應(yīng)。

3 DENV的分子生物學(xué)檢測(cè)方法

與傳統(tǒng)的病毒分離法相比，分子生物學(xué)檢測(cè)方法的敏感性更高、更快速，十幾年來發(fā)展迅速，有良好的應(yīng)用前景。

3.1 依賴核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)

依賴核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)（nucleic acid se?quence-based amplification，NASBA）是一種以 RNA為模板進(jìn)行等溫核酸擴(kuò)增的方法，可用于DENV擴(kuò)增[16-17]。此法借助逆轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶H、RNA聚合酶和2對(duì)特異性引物實(shí)現(xiàn)。這種化學(xué)發(fā)光法操作簡便，靈敏度為98.5%，特異性為100%[17-18]，可檢測(cè)樣本中低于25 PFU/mL的DENV RNA，適合在登革暴發(fā)地區(qū)快速檢測(cè)。

3.2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種等溫?cái)U(kuò)增方法，其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，不需要熱變性的DNA作為模板，在恒溫下就可高效、快速、高特異地?cái)U(kuò)增靶序列。利用鏈置換DNA聚合酶在等溫（63℃左右）條件下保溫30～60 min即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。LAMP的結(jié)果判斷有多種方法，陽性產(chǎn)物電泳可見特殊的階梯狀條帶，或加入熒光染料觀察熒光強(qiáng)度，或顏色改變判斷是否為陽性反應(yīng)，借助副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀離心后產(chǎn)生白色沉淀，或通過濁度儀實(shí)現(xiàn)定量。該方法適合基礎(chǔ)條件較為薄弱的基層或現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)室，反應(yīng)時(shí)間短，不需要特殊儀器設(shè)備，肉眼可觀察結(jié)果，具有很強(qiáng)的實(shí)用性。LAMP技術(shù)目前在國內(nèi)外得到廣泛推廣及應(yīng)用，RT-LAMP法可用于DENV檢測(cè)[19]。

3.3 轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增方法

轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增方法（transcription mediated amplification，TMA）是目標(biāo)序列單鏈RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，引物1引導(dǎo)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，形成RNA/DNA雜交雙鏈分子，逆轉(zhuǎn)錄酶的RNA酶H活性將雜合鏈上的RNA降解后，引物2引導(dǎo)合成雙鏈DNA，由于在引物1上設(shè)計(jì)有T7啟動(dòng)子結(jié)合區(qū)，雙鏈DNA在T7RNA多聚酶作用下轉(zhuǎn)錄出100～1000個(gè)目標(biāo)RNA序列，這些RNA又可作為模板進(jìn)行下一個(gè)循環(huán)，整個(gè)反應(yīng)是一個(gè)自催化過程。TMA檢測(cè)DENV RNA在RT-PCR檢測(cè)陰性的急性期血清樣本中有80%的檢出率，在RT-PCR檢測(cè)陽性的急性期血清樣本中檢出率達(dá)100%，即總檢出率達(dá)89%[20]。

3.4 實(shí)時(shí)PCR法

實(shí)時(shí)PCR（real time-PCR，RT-PCR）是目前快速診斷DENV的最好方法之一，靈敏度范圍58.9%～100%，檢測(cè)閾0.1～3.0 PFU[21-27]。RT-PCR的定量用熒光色素實(shí)現(xiàn)，目前常用的2種是能與增幅DNA序列中特定寡核酸序列相結(jié)合的熒光探針如TaqMan探針，以及能在雙鏈DNA中插入的特異熒光色素如SYBR greenⅠ。由于SYBR greenⅠ可結(jié)合到任何雙鏈DNA，包括引物二聚體和非特異性產(chǎn)物上，影響目標(biāo)產(chǎn)物的濃度檢測(cè)，因此對(duì)引物的要求較高。TaqMan熒光探針雜交法只能在單管mRNA上使用，試驗(yàn)費(fèi)用較高昂。

RT-PCR引物來自DENV基因組的不同區(qū)域，可用于臨床檢測(cè)DENV及確定血清型。Lanciotti最早建立的兩步法巢式RT-PCR中[28]，2組與C/prM區(qū)對(duì)應(yīng)的引物比較常用，包含用于第一輪擴(kuò)增的外引物及鑒定4種血清型的特異性引物。經(jīng)過2次PCR擴(kuò)增，病毒基因組的信息量擴(kuò)大，有助于提高檢測(cè)的敏感性，方便檢出病毒，同時(shí)還可鑒定具體的血清型及分辨混合感染。

為降低樣本交叉污染帶來的假陽性，Harris等建立了一種單管復(fù)式RT-PCR法[29]，對(duì)1～4血清型DENV的最低檢測(cè)閾分別為1、50、1、30 PFU。有研究證明一步法比兩步法具有更高的檢出率[30]，值得臨床實(shí)驗(yàn)室推廣。

目前RT-PCR法和其他方法聯(lián)用診斷DENV越來越常見。如將一步法RT-PCR與單酶切-限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)（restriction fragment length polymorphism，RFLP）相結(jié)合，可以更快速有效地鑒定DENV分型。Vorndam首先報(bào)道了RT-PCR/RFLP技術(shù)可鑒別DENV的地理亞群，但需要擴(kuò)增整個(gè)病毒基因組[31]。經(jīng)Gaunt和Gould改進(jìn)后，RT-PCR/RFLP法可鑒別90%的已知E基因序列的黃病毒。2012年Ortiz等建立了一種新的一步法RT-PCR與單酶RFLP法結(jié)合，只需24 h就可鑒別DENV的4種血清型、黃熱病病毒、西尼羅河病毒和圣路易斯腦炎病毒，且特異性高于95%[32]。

由于PCR反應(yīng)的引物、酶、緩沖液、反應(yīng)條件、病毒的基因組靶區(qū)域和PCR儀都可能影響PCR結(jié)果，而各地的條件都不相同，因此很難界定哪一種分子生物學(xué)檢測(cè)方法更好，需要結(jié)合本地的實(shí)際條件加以應(yīng)用。各種分子生物學(xué)檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)尚未統(tǒng)一，需要進(jìn)一步研究摸索，相關(guān)的分子學(xué)檢測(cè)試劑盒也正在開發(fā)。

3.5 生物傳感器

生物傳感器是生物診斷設(shè)備，既可定性也可定量檢測(cè)[33]，具有快速、靈敏、特異性高的優(yōu)點(diǎn)，如能實(shí)現(xiàn)便于攜帶、自動(dòng)化程度高的試劑盒商業(yè)化要求，將會(huì)有很好的應(yīng)用前景。DENV生物傳感器在2000年開始出現(xiàn)，并不斷得到改進(jìn)[34-40]。

人類的基因組DNA可能會(huì)影響病毒RNA的選擇，因此生物樣本的純化和化學(xué)修飾十分重要。微流體設(shè)備（芯片實(shí)驗(yàn)室）和基于一次性芯片的技術(shù)可用于樣本預(yù)處理，然而考慮到場(chǎng)地要求、設(shè)備要求和資金能力，這些設(shè)備可能不完全適于快速檢測(cè)試驗(yàn)的基本要求。當(dāng)前大多數(shù)DENV生物傳感器類型為壓電晶體生物傳感器、光生物傳感器和電化學(xué)生物傳感器[33]。

在壓電式傳感器中，2種不同的單克隆抗體固定在一個(gè)壓電式傳感器上，它們之間是一個(gè)免疫芯片，傳感器可探測(cè)糖蛋白E和非結(jié)構(gòu)蛋白NS1[41]，還有的使用分子印跡聚合物來識(shí)別登革病毒NS1蛋白的抗原決定部位[42]。這樣的設(shè)計(jì)規(guī)避了合成單抗的使用，可獲得較高的靈敏度和特異性[35]。最近，芯片技術(shù)發(fā)展為通過互補(bǔ)的寡核苷酸特異性雜交進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR，效果與RT-PCR相同[43-44]。此方法易發(fā)生內(nèi)源性和外源性互相干擾，因此對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備的要求很高。

一種化學(xué)發(fā)光的光學(xué)纖維免疫傳感器能與酶聯(lián)免疫吸附法獲得類似的DENV檢測(cè)效果，且靈敏度更高，或可用于無癥狀患者的檢驗(yàn)[35]，它的缺點(diǎn)是重復(fù)性差。其他利用光學(xué)途徑的方法如磁珠、脂質(zhì)體、報(bào)告探針等仍需要昂貴和復(fù)雜的分析儀器，復(fù)雜的數(shù)據(jù)處理或其他電子設(shè)備，花費(fèi)多，設(shè)備不易攜帶，不易商業(yè)化[33]，限制了它們的臨床使用。

4 結(jié)語

DENV的暴發(fā)和流行給社會(huì)帶來很大負(fù)擔(dān)，DENV疫苗可能在5～7年后上市[45-47]。對(duì)患者而言，DENV快速準(zhǔn)確的診斷必不可少，即便以后有疫苗和抗DENV藥物上市，DENV的檢測(cè)技術(shù)作為評(píng)價(jià)其效果的手段也是非常必要的?？紤]到病毒變異的可能，以及DENV檢測(cè)技術(shù)隨著醫(yī)療技術(shù)水平的不斷提高，未來的檢測(cè)技術(shù)很可能在分子水平上進(jìn)展得更深更遠(yuǎn)。

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