長距離實(shí)時定量PCR技術(shù)及其在DNA損傷研究中的應(yīng)用

梁姣 王淑紅 張子平 王藝?yán)?/p>

（1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廈門 361021；2.西東大學(xué)生物系，新澤西州 07079）

DNA作為生物機(jī)體中重要的遺傳物質(zhì)，其本身攜帶著生命體所有的遺傳信息，DNA的完整性關(guān)系到生物體的生長、發(fā)育、遺傳、代謝和繁殖等多種重要的生物學(xué)過程。然而，生物機(jī)體在自身復(fù)制、轉(zhuǎn)錄過程中以及暴露于各種外界環(huán)境下，極易受到體內(nèi)或外界因素的影響而產(chǎn)生DNA損傷，正常情況下，大部分的損傷能夠被細(xì)胞識別并予以修復(fù)，但當(dāng)DNA損傷比較嚴(yán)重或機(jī)體DNA損傷修復(fù)能力缺失，機(jī)體無法正常修復(fù)時，帶有這種損傷的DNA就會進(jìn)入半保留復(fù)制過程，很容易發(fā)生堿基錯配，從而引起細(xì)胞凋亡，甚至促使機(jī)體形成腫瘤，以及形成各種治療癌癥細(xì)胞的阻力［1-4］。

造成生物機(jī)體DNA損傷的因素有很多。生物體氧化-還原反應(yīng)代謝過程中產(chǎn)生的自由基，DNA自身在復(fù)制重組過程中發(fā)生的錯配，堿基替換，另外在電離輻射和紫外線照射情況下也會產(chǎn)生氧自由基，環(huán)境中化學(xué)物質(zhì)亦能造成一定程度的DNA損傷。常見的DNA損傷會引起腫瘤、癌癥［5，6］、糖尿病、心血管疾病及神經(jīng)退行性疾病等［7-10］。因此，DNA損傷作為外來化合物對機(jī)體毒性作用的一個指標(biāo)，在分子毒理上的應(yīng)用越來越廣泛。同時，DNA損傷也被用于環(huán)境化學(xué)物的遺傳毒性、生物個體環(huán)境暴露水平和腫瘤罹患危險度的評價。

1 DNA損傷的類型

外來化合物引起的DNA損傷有多種不同的類型，歸結(jié)起來，可分為4種主要的類型：（1）堿基損傷，包括形成嘧啶二聚體、堿基共價化合物、堿基烷基化和堿基缺失、轉(zhuǎn)換、顛換；（2）糖基破壞；（3）DNA鏈交聯(lián)，包括DNA鏈內(nèi)交聯(lián)、鏈間交聯(lián)和DNA蛋白質(zhì)交聯(lián)；（4）鏈斷裂［11］，其中鏈斷裂中的單鏈斷裂（single strand break，SSB）是由于間接的DNA損傷所引起的。同時，單鏈斷裂也是由于DNA核糖損傷程度增加直接引起，以及受到內(nèi)源性活性氧或過氧化氫、電離輻射攻擊而產(chǎn)生［12］，更嚴(yán)重的會引起雙鏈斷裂（double strand break，DSB）［13］。

2 DNA損傷檢測的方法及優(yōu)缺點(diǎn)

近年來，研究者陸續(xù)建立了很多DNA損傷的檢測方法，如線粒體基因拷貝數(shù)［14］，限制性酶切片段長度多態(tài)性分析（restriction fragment length polymorphisms，RFLP）［15］及溫度梯度凝膠電泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）［16］等。另外，還包括單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)（彗星試驗(yàn)，comet assay）［17］、堿解旋（alkaline unwinding）［18］和微核測定法（micronuclei test）［19］等。雖然這些方法各有特點(diǎn)，但DNA損傷研究對象都集中在基因組，不能對特定基因的損傷進(jìn)行直觀或精確的定位定量檢測與分析。此外，這些方法對DNA損傷的程度也不能做到精確的定量。目前，雖有一些可用于特定基因檢測的方法，如單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single-strand conformation polymorphism，SSCP）［20］和8-氧基鳥嘌呤（8-oxoG）［21］的分析測定，但這些方法主要用于堿基突變或特定堿基損傷的檢測，而不能檢測基因的總體損傷情況。同時，這些方法都需要大量的DNA及引物，而8-oxoG雖然不需要引物，但經(jīng)常需要和其他技術(shù)，如高效液相色譜-電化學(xué)法、酶聯(lián)免疫吸附法等結(jié)合使用［22］，工作量大且耗時較長。

3 PCR技術(shù)在DNA損傷研究中的應(yīng)用

日本Higuchi等［23］于1992年首次采用動態(tài)PCR方法和封閉式檢測方法對目的核酸數(shù)量進(jìn)行定量分析，提出熒光定量PCR技術(shù)的概念。1995年，美國Applied Biosystems公司成功研制了TaqMan技術(shù)，1996年又推出了首臺熒光定量PCR檢測系統(tǒng)。該系統(tǒng)通過在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料，使之與雙鏈DNA結(jié)合從而收集熒光信號，利用收集的熒光信號再對整個PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測，并使用Ct值進(jìn)行分析，通過做標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析［24，25］。相較于常規(guī)PCR方法無法對起始模板準(zhǔn)確定量且只能對終產(chǎn)物進(jìn)行分析的局限性，實(shí)時定量PCR方法是目前確定樣品中DNA（cDNA）拷貝數(shù)最敏感、最準(zhǔn)確的方法，具有自動化程度高、重現(xiàn)性好和無污染等特點(diǎn)，目前已經(jīng)在分子生物學(xué)領(lǐng)域和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的使用。

常規(guī)Real-time QPCR技術(shù)應(yīng)用于DNA損傷的研究雖早已有報道，但其通常需要與其他技術(shù)結(jié)合使用，并且操作步驟繁瑣，同時也增加了試驗(yàn)過程中誤差形成的可能性。Neher等［26］通過單個線蟲暴露于苯并芘和熒蔥中，用提取的DNA先采用PCR技術(shù)擴(kuò)增出ced-1基因16 144 bp和rpa-1 281 bp長度的片段，進(jìn)而通過Real-time QPCR技術(shù)從擴(kuò)增的ced-1基因中選擇109 bp的片段作為擴(kuò)增的目的片段，rpa-1中選擇81 bp的片段作為擴(kuò)增的參比片段，經(jīng)苯并芘和熒蔥處理下的DNA會形成加合物，而加合物的存在會抑制DNA的擴(kuò)增。將處理組目的片段和參比片段的比值與未處理組目的片段和參比片段的比值相比，當(dāng)比值≤0.05時，表明有抑制了PCR反應(yīng)的DNA加合物的存在。通過Real-time QPCR結(jié)合8-oxoG技術(shù)，孫玉等［27］采用亞甲藍(lán)聯(lián)合可見光（MBL）方法處理肝癌細(xì)胞株（HepG2），使得DNA鏈中鳥嘌呤被氧化成8-oxoG，而8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶（8-oxoguanine DNA glycosydase）可特異切割8-oxoG位點(diǎn)，與未經(jīng)處理的DNA相比，經(jīng)酶切后完整的DNA模板減少，再經(jīng)Real-time QPCR法擴(kuò)增時，表現(xiàn)為Ct值較大的現(xiàn)象，從而可以反推DNA中8-oxoG的含量，進(jìn)而成功構(gòu)建了DNA的氧化損傷模型。

Rothfuss等［28］利用Real-time QPCR分析神經(jīng)母瘤細(xì)胞系SH-SY5Y經(jīng)H2O2暴露后線粒體基因組不同位置DNA損傷情況，試驗(yàn)過程中，選取線粒體ND5、ND1/ND2、COⅡ/ATPase6/8及D-Loop 4個位置，擴(kuò)增其大小在1 kb左右的片段，根據(jù)mtDNA區(qū)域每10 kb DNA所包含對應(yīng)長片段的長度計算出DNA的損傷，得出線粒體DNA損傷率與擴(kuò)增片段的長度成反比的結(jié)論，并驗(yàn)證了線粒體不同區(qū)域?qū)p傷的敏感程度不同的說法。

Santons等［29］在研究哺乳動物細(xì)胞核DNA，線粒體DNA損傷及修復(fù)的過程中建立了一種長距離PCR的方法，該種方法檢測DNA損傷的原理是基于多種類型的DNA損傷都可以減緩或阻止DNA聚合酶的進(jìn)程。其優(yōu)點(diǎn)在于能直接從總DNA中直接檢測線粒體DNA的完整性而不用再單獨(dú)分離出線粒體DNA，并且能夠準(zhǔn)確的檢測核DNA和線粒體DNA的損傷程度。之后，很多學(xué)者將該技術(shù)應(yīng)用于人類疾病和模式生物DNA損傷的檢測。Jung等［30］用長距離定量PCR（LA-QPCR）方法檢測大西洋鳉魚線粒體DNA和核DNA損傷的情況，通過向相對未受污染的魚體內(nèi)注射苯并芘，測定肝、腦、肌肉組織中DNA的損傷程度。同時，還檢測了受污染區(qū)域的大西洋鳉魚肝、肌肉DNA的損傷，認(rèn)為長距離定量PCR技術(shù)為評估DNA損傷提供了靈敏的檢測手段。在研究人類疾病方面，長距離定量PCR技術(shù)也發(fā)揮了重要作用。用此方法，Van等［31］驗(yàn)證了正常人類的成纖維細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的次黃嘌呤轉(zhuǎn)移酶基因比非轉(zhuǎn)錄的beta-球蛋白基因修復(fù)率更高的說法。而Fukagawa等［32］也采用長距離定量PCR的方法驗(yàn)證了衰老和基因肥胖型會造成體內(nèi)線粒體DNA缺失。此外，長距離定量PCR技術(shù)還可用于檢測人肺癌細(xì)胞系PLK3/PRK基因內(nèi)含子及外顯子的結(jié)構(gòu)和多態(tài)性分析［33］。

盡管LA-QPCR技術(shù)在DNA損傷檢測方面得到很多的應(yīng)用，但該方法采用的是終點(diǎn)檢測法，對模板濃度和PCR循環(huán)數(shù)都有較高的要求，不能對PCR情況進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測。近年來，一些學(xué)者考慮將實(shí)時定量PCR技術(shù)和長距離定量PCR技術(shù)結(jié)合。Vidal等［34］于2005年最早報道了LA-real time QPCR技術(shù)在檢測A型血友病凝血因子VIII基因22號內(nèi)含子倒置試驗(yàn)中的應(yīng)用。該研究分別擴(kuò)增了陽性個體，陰性個體及女性A型血友病攜帶者3個試驗(yàn)組內(nèi)含子區(qū)域12 kb及11 kb長度的片段，并根據(jù)Ct值的大小可以一步快速檢測A型血友病VIII基因突變的情況。Maruyama等［35］應(yīng)用LA-real time QPCR技術(shù)擴(kuò)增了4.1 kb、8.5 kb和15.5 kb的質(zhì)粒片段，可以靈敏的檢測河流中胞外質(zhì)粒的存在。Edwards［22］采用LA-real time QPCR技術(shù)成功擴(kuò)增了15 kb 幾乎可以覆蓋整個線粒體基因組的長片段，可以快速，高重復(fù)性的檢測線粒體的DNA損傷。

4 長距離實(shí)時定量PCR技術(shù)

常規(guī)的Real-time QPCR，為了保證擴(kuò)增效率，擴(kuò)增目的片段的長度要求在50-300 bp之間，一般不會超過400 bp［36］。LA-QPCR能夠擴(kuò)增的目的片段可達(dá)20 kb左右［37，38］，這就對PCR反應(yīng)條件提出了很多的挑戰(zhàn)。經(jīng)過多次探索并參考前人的研究結(jié)果，結(jié)合Real-time QPCR技術(shù)和LA-PCR技術(shù)，我們建立了一整套LA-real time QPCR的相關(guān)技術(shù)，現(xiàn)詳細(xì)介紹如下。

4.1 DNA模板

LA-real time QPCR擴(kuò)增DNA的片段長度可以達(dá)到20 kb，這就要求所提取的DNA具有高度的完整性，生物體基因組DNA的鏈一般比較長，在提取DNA的過程中，由于用力過猛或試驗(yàn)操作不當(dāng)，很容易造成DNA鏈的斷裂。我們知道，在PCR擴(kuò)增的過程中，引物分正向、反向同時從3'和5'端向中間擴(kuò)增，如果DNA鏈發(fā)生斷裂，PCR擴(kuò)增就會中斷，近而影響PCR的擴(kuò)增效率。因此，在裂解組織塊的過程中，我們使用研磨棒研磨組織塊，加入細(xì)胞裂解液后水浴裂解細(xì)胞，而非使用均漿機(jī)對組織快速研磨，同時提取DNA時，動作要輕緩，加入試劑后盡量避免反復(fù)吹打。在整個LA-real time QPCR的過程中，模板質(zhì)量很重要，因?yàn)槟０彘L度較長，在利用瓊脂糖凝膠電泳檢測模板質(zhì)量時，膠的濃度要控制在0.6%左右。目前市售的適合長片段DNA檢測的marker已有多種，例如，TaKaRa、天根生化科技公司等生產(chǎn)的λ-Hind Ⅲ digest DNA marker。

4.2 DNA聚合酶

TaKaRa公司研制的LA-Taq是應(yīng)用LA-PCR原理研制的具有3'→5'核酸外切酶的活性（具有校對，Proof reading的活性）的耐熱性DNA聚合酶。無論是擴(kuò)增短鏈DNA還是長鏈DNA，其效率都優(yōu)于其他同類產(chǎn)品，尤其在擴(kuò)增大于10 kb的DNA片段方面，其優(yōu)勢更加明顯，而且保真性很強(qiáng)。在PCR進(jìn)程中高溫加熱前抗Taq單克隆抗體與LA-Taq酶結(jié)合，抑制聚合酶的活性，從而抑制低溫條件下由引物的非特異性退火或引物二聚體引起的非特異性擴(kuò)增，能更有效地減少PCR過程中的非特異性反應(yīng)，增強(qiáng)PCR擴(kuò)增的特異性，得到良好的PCR結(jié)果［39］。

4.3 熒光染料

在熒光定量PCR反應(yīng)體系中，需要加入熒光報告基團(tuán)以確定反應(yīng)過程中擴(kuò)增產(chǎn)物的量的變化。而常用的熒光染料包括SYBR Green Ⅰ，這是一種非飽和菁類熒光素，能夠特異的識別雙鏈DNA并結(jié)合在DNA雙鏈上［40］，是應(yīng)用最廣泛的化學(xué)檢測物質(zhì)，但這種結(jié)合也是非特異的，它能夠與任何的dsDNA（如引物二聚體等）結(jié)合，造成試驗(yàn)的假陽性結(jié)果。另外，還會出現(xiàn)的另一個問題是它會抑制PCR的進(jìn)程，優(yōu)先結(jié)合G+C含量豐富的片段［41］，當(dāng)擴(kuò)增的片段較短時，SYBR Green Ⅰ對PCR反應(yīng)的抑制作用影響不大，但當(dāng)擴(kuò)增片段的長度大于10 kb左右的情況下，SYBR Green Ⅰ的抑制作用將使PCR不能正常擴(kuò)增。我們在試驗(yàn)中采用了不同濃度的SYBR GreenⅠ都未能成功擴(kuò)增出長度為14 092 bp的斑馬魚線粒體片段。

在本實(shí)驗(yàn)室建立的LA-real time QPCR技術(shù)中所采用的熒光染料為SYTO-82。Gudnason等［41］的研究表明，SYTO-82不抑制PCR的進(jìn)程，不會優(yōu)先結(jié)合G+C含量豐富的片段，而且較高的工作濃度也不會影響解鏈溫度和Tm值。因此，在LA-real time QPCR 時使用SYTO-82作為熒光染料，得到了較好的擴(kuò)增效率（E=1.696），且不同模板濃度下R2=0.994，說明擴(kuò)增效率重現(xiàn)性很好，即使用SYTO-82作為熒光染料擴(kuò)增片段長度為14 092 bp的片段仍可以得到良好的擴(kuò)增效率。同時為了平衡PCR加樣誤差所引起的PCR管與管之間的差異，在PCR反應(yīng)體系中加入ROX參考染料［42］。

4.4 引物

引物的選擇是PCR能否成功擴(kuò)增的關(guān)鍵，一般來說，長片段引物的堿基數(shù)要比普通PCR反應(yīng)所需的引物要長，一般為24±2個核苷酸，這樣能夠增加其與模板結(jié)合的穩(wěn)定性；而且G+C含量也要控制在50%左右。決定PCR反應(yīng)的另一個重要因素是引物的Tm值，因?yàn)閿U(kuò)增的片段比普通PCR反應(yīng)較長，這就需要Tm值也比普通的較高，其范圍應(yīng)該在68℃左右。與普通PCR的引物設(shè)計一樣，在設(shè)計長片段引物的過程中，也要考慮錯配和引物二聚體的問題，從而使引物的設(shè)計符合長片段PCR反應(yīng)的要求［29］。

4.5 數(shù)據(jù)分析

在使用常規(guī)實(shí)時定量PCR技術(shù)研究基因表達(dá)的過程中，樣本間的誤差會干擾試驗(yàn)數(shù)據(jù)，為了得到更精確的數(shù)據(jù)，通常需要一個或多個內(nèi)參基因來消除起始樣本的誤差及反應(yīng)效率的誤差。一般常選擇看家基因（housekeeping gene）作為內(nèi)參［28、43，44］，LA-real time QPCR也需要相應(yīng)的內(nèi)參對DNA中某片段的初始濃度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以消除樣品提取過程中產(chǎn)生的影響。首先選取長度約20 kb的DNA片段，設(shè)計引物，擴(kuò)增出較長的片段，在擴(kuò)增的長片段中選取200 bp左右長度的片段，設(shè)計引物擴(kuò)增該片段，因選取的短片段與長片段在同一個序列中，相對于長片段，短片段受損傷的幾率很低，其拷貝數(shù)可以用來校準(zhǔn)長片段的拷貝數(shù)。

常規(guī)的Real-time QPCR技術(shù)一般采用2-ΔΔCt的方法計算目的基因的相對表達(dá)量，該方法是建立在參比基因和目的基因的擴(kuò)增效率都接近100%的基礎(chǔ)上的。但是，當(dāng)擴(kuò)增的片段較長時，無論怎么優(yōu)化條件，其擴(kuò)增效率不可能達(dá)到100%。Rothfuss等［28］根據(jù)Real-time QPCR建立起來的半長距離實(shí)時定量PCR（Semi-long real time PCR）技術(shù)雖然擴(kuò)增的長度在1 kb左右，但1 kb的片段擴(kuò)增效率在69.4%-89%之間，在分析數(shù)據(jù)時他們?nèi)圆捎昧?-ΔΔCt的計算方式，致使結(jié)果有很大的誤差。而本試驗(yàn)在擴(kuò)增斑馬魚線粒體長度為14 092 bp的片段時，計算得出的擴(kuò)增效率為69.6%。因此，我們在數(shù)據(jù)分析時，采用ET

CtT（C）-CtT（S）/ERCtR（C）-CtR（S）的公式［45］，公式中ET、ER分別指長距離片段和短距離片段的擴(kuò)增效率，CtT（C）-CtT（S）、 CtR（C）-CtR（S）分別指長距離片段和短距離片段介導(dǎo)的處理組和對照組DNA模板定量擴(kuò)增得到的Ct值，數(shù)據(jù)分析考慮了不同片段的擴(kuò)增效率，使結(jié)果更加準(zhǔn)確。

5 結(jié)語

隨著人們對DNA損傷及其修復(fù)機(jī)制研究的不斷深入，對于DNA損傷檢測技術(shù)的要求也越來越高。LA-real time QPCR技術(shù)由于所需DNA量少，檢測靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，盡管在區(qū)分不同類型和具體損傷位點(diǎn)方面有所欠缺，但就現(xiàn)有的試驗(yàn)技術(shù)而言，LAreal time QPCR無疑為DNA損傷的檢測提供了更為方便快捷的技術(shù)手段。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，或與其他檢測方法的聯(lián)合應(yīng)用，相信LA-real time QPCR在檢測環(huán)境污染物對生物體DNA損傷以及人類一些相關(guān)疾病的診斷方面將會得到越來越多的應(yīng)用。

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