根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物的研究進(jìn)展與對策

張潔 周巖

（河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003）

自1983年成功獲得第一例農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因煙草以來，有關(guān)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的應(yīng)用研究逐步發(fā)展成為植物基因工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化植物的研究也日益廣泛和深入。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法具有轉(zhuǎn)化植物受體，操作易行，經(jīng)濟(jì)簡便，可插入大片段DNA，整合于基因組上的外源基因拷貝數(shù)少且重排程度低，技術(shù)儀器要求低，轉(zhuǎn)化效率高等頗多優(yōu)點(diǎn)。

由于單子葉植物不是農(nóng)桿菌的天然宿主，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對單子葉植物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的研究因此受到限制。Portrykus［1］曾認(rèn)為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物是不可能的。禾谷科作物如水稻、小麥、玉米都是單子葉植物，是人類重要的糧食作物，利用基因工程技術(shù)對該類植物的研究具有十分重要的價值。近年來，隨著農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化機(jī)制和影響因素的進(jìn)一步研究以及轉(zhuǎn)化方法的不斷完善，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法已逐步發(fā)展成為大部分雙子葉植物和一部分單子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化的主流方法，以及植物基因工程中不可或缺的研究工具，具有極大的應(yīng)用價值。本文是針對近年來根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物的研究進(jìn)展以及存在的問題與提高轉(zhuǎn)化效率的對策進(jìn)行了綜述。

1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的機(jī)理

農(nóng)桿菌是一種革蘭氏陰性土壤桿菌，含有一種與腫瘤誘導(dǎo)相關(guān)的Ti質(zhì)粒，其上含有可轉(zhuǎn)移DNA （T-DNA ）區(qū)、毒性區(qū)（Vir區(qū)）、結(jié)合區(qū)（Con區(qū)）和復(fù)制起始區(qū)（Ori區(qū)）4個部分。其中，T-DNA 是能夠轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞內(nèi)，并與植物基因組整合而得以表達(dá)的區(qū)段，其左右各有 25 bp 的重復(fù)序列邊界。因此，可以通過將外源基因插入T-DNA 區(qū)段上以實(shí)現(xiàn)外源目的基因的轉(zhuǎn)移以及在植物細(xì)胞中的表達(dá)，從而改變植物的遺傳性狀。

當(dāng)植物受到傷害時，會分泌釋放含有酚類化合物的物質(zhì)，這些酚類化合物可以促使農(nóng)桿菌向植物受傷部位移動并附著于植物細(xì)胞的表面，還可以誘導(dǎo) VirA 基因的表達(dá)，VirA 基因經(jīng)磷酸化后便可激活作為轉(zhuǎn)錄活化因子的 VirG 蛋白，從而與多個 Vir 基因的產(chǎn)物結(jié)合，對 T-DNA 開始從右邊界向左邊界進(jìn)行切割，產(chǎn)生一條 T-DNA 單鏈，T-DNA 單鏈可與VirD2 、VirE2 蛋白結(jié)合，最終形成 T-復(fù)合體。T-復(fù)合體隨之被釋放到農(nóng)桿菌細(xì)胞外，經(jīng)由 VirB 蛋白在植物細(xì)胞壁上形成的通道進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)，并在 VirD2 和 VirE2 核定位信號的引導(dǎo)下，被轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白識別通過核孔進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)，使T-DNA插入植物的核染色體中，這便完成了 T-DNA 由農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞核并進(jìn)行整合的過程。

由于農(nóng)桿菌 Ti 質(zhì)粒具有天然的轉(zhuǎn)移 DNA 特性，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成為目前植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中最經(jīng)濟(jì)簡單、研究最深入、發(fā)展最成熟的轉(zhuǎn)基因方法。

2 根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物的研究進(jìn)展

1984年，Hernalstenns［2］通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功轉(zhuǎn)化單子葉植物石刁柏的應(yīng)用報道，首次證實(shí)了根癌農(nóng)桿菌是可以轉(zhuǎn)化單子葉植物的，并為根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物的研究提供了理論依據(jù)和技術(shù)支撐，為近年來單子葉植物的轉(zhuǎn)化研究的不斷發(fā)展奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。目前，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化成功的單子葉植物涉及到禾本科、百合科、石蒜科等，并取得了豐碩成果。

2.1 小麥

第一株轉(zhuǎn)基因小麥?zhǔn)窃?992年通過基因槍法獲得的，一直以來，基因槍法占據(jù)著小麥轉(zhuǎn)基因手段的重要位置［3］；其次是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)獲得的第一株轉(zhuǎn)基因小麥誕生于1997年，Cheng等［4］以剛剝離的幼胚、預(yù)培養(yǎng)的幼胚和幼胚愈傷組織為受體材料，利用 35S 啟動子和 HSP70 內(nèi)含子構(gòu)建的農(nóng)桿菌表達(dá)載體在小麥上得到了高達(dá)4.3%的轉(zhuǎn)化頻率。隨后，人們對農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化小麥的研究不斷廣泛和深入。由于小麥不是農(nóng)桿菌的天然受體，其基因組相對較大，遺傳背景復(fù)雜，基因型依賴性較強(qiáng)，因而，是轉(zhuǎn)化難度較大的單子葉植物之一。因此，轉(zhuǎn)化效率還較低。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得的轉(zhuǎn)基因小麥也較少。但隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷發(fā)展，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化小麥的研究日益成熟，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功將諸多有應(yīng)用價值的優(yōu)良外源基因轉(zhuǎn)入小麥的相關(guān)報道日趨豐富。

郭麗等［5］采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，以小麥成熟胚為轉(zhuǎn)化受體，建立了小麥轉(zhuǎn)化體系，對轉(zhuǎn)化再生植株進(jìn)行報告基因 GUS 的 PCR 檢測結(jié)果表明供試3株小麥的 PCR 均為陽性，轉(zhuǎn)基因植株的 GUS 活性也明顯高于對照。劉香利等［6］以小麥綿陽 19 和洛陽 8716 幼胚愈傷組織為受體材料，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將小麥高分子量麥谷蛋白亞基 1Bx14 基因轉(zhuǎn)入其中，并經(jīng)潮霉素抗性篩選、PCR 和 PCRSouthern 雜交檢測，獲得平均轉(zhuǎn)化率為 0.61%。石珍源等［7］利用農(nóng)桿菌菌系 C58C1 將 GUS 基因和 npt Ⅱ 基因轉(zhuǎn)入 18 個普通小麥經(jīng)破碎處理的大齡幼胚中，經(jīng) PCR 檢測，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。張?jiān)骆玫龋?］以揚(yáng)麥 158 和華麥 13 幼胚為受體材料，建立了通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將 ACE-D2 基因?qū)胄←湹倪z傳轉(zhuǎn)化體系，獲得的 T0 和 T1 代轉(zhuǎn)化植株，經(jīng) PCR 分析鑒定表明，外源基因已經(jīng)整合到小麥基因組中。

2.2 玉米

玉米是世界重要的三大糧食作物之一，也是一種優(yōu)質(zhì)飼料，在畜牧業(yè)中占據(jù)著舉足輕重的地位，亦是工業(yè)生產(chǎn)淀粉、酒精等產(chǎn)品的主要原料。因此，全世界對玉米的需求量呈上升趨勢，如何快速提高玉米的產(chǎn)量也成為迫切需要解決的問題。近年來，轉(zhuǎn)基因技術(shù)與傳統(tǒng)育種的相互結(jié)合，促進(jìn)了玉米遺傳改良研究的深入發(fā)展，而且也開辟了獲得玉米種質(zhì)資源的一條新途徑。第一株通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得的轉(zhuǎn)基因玉米誕生于1996年，Ishida 等［9］在前人探索與研究的基礎(chǔ)上，利用農(nóng)桿菌 LBA4404 轉(zhuǎn)化玉米自交系 A188 幼胚，獲得了轉(zhuǎn)基因玉米，且轉(zhuǎn)化率達(dá)5%-30%，并且證明了外源基因的成功整合、表達(dá)以及穩(wěn)定遺傳。該研究在一定程度上充分證實(shí)了玉米通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的可行性，并為今后的研究提供了可靠的科學(xué)依據(jù)。

孫傳波等［10］將抗草甘膦 EPSPS 基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入玉米自交系鄭 58 的莖尖中，經(jīng) PCR 檢測，7 株轉(zhuǎn)化植株呈陽性，轉(zhuǎn)化率達(dá)7.14%，初步證明外源基因已經(jīng)整合到玉米基因組中。劉建波［11］利用中間載體 pGM-T-RP5 和 pGM-T-AGPL，將水稻胚乳特異型啟動子 RP5 和玉米合成關(guān)鍵酶基因 AGPL 定向連接到表達(dá)載體 pCAMBIA3301 上，構(gòu)建表達(dá)載體 pRP5-AGPL，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對玉米自交系 Y9812 幼胚進(jìn)行轉(zhuǎn)化，經(jīng) PCR 分子檢測獲得 17 株陽性植株。李曉麗等［12］以玉米自交系齊 319 莖尖分生組織為受體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將玉米胚乳特異啟動子基因 15 kD β-Zein 驅(qū)動的大豆鐵蛋白 ferritin 基因轉(zhuǎn)入玉米，共篩選出 272 株除草劑抗性植株，其中 108 株 PCR 檢測呈陽性，轉(zhuǎn)化率達(dá)3.6%，初步判斷外源基因已轉(zhuǎn)入玉米基因組中。葛敏等［13］將 As/Ds 雙元表達(dá)載體（包含抗蟲Cry1 Ab/Ac基因和 gfp 報告基因等）通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入玉米自交系 H99 幼胚愈傷組織中，經(jīng) PCR 檢測 8 株轉(zhuǎn)化植株目的基因已整合且有效表達(dá)，轉(zhuǎn)化效率達(dá)7%。

2.3 水稻

水稻作為主要的糧食作物之一，其產(chǎn)量與品質(zhì)的提高對于解決全球人口糧食問題以及提升人類生活質(zhì)量都具有重要意義。在傳統(tǒng)育種的基礎(chǔ)上，分子生物技術(shù)的快速發(fā)展加速了水稻的遺傳改良進(jìn)程。近20年來，水稻遺傳轉(zhuǎn)化從起初的完全否定、認(rèn)為難以轉(zhuǎn)化到能夠轉(zhuǎn)化的可行性斷定結(jié)論，再從低頻轉(zhuǎn)化、對轉(zhuǎn)化體系的不斷優(yōu)化研究到高頻轉(zhuǎn)化，以及實(shí)現(xiàn)大量優(yōu)質(zhì)外源基因的成功轉(zhuǎn)化整合。在這一過程中，水稻遺傳轉(zhuǎn)化研究取得了突破性的進(jìn)展以及豐碩的成果。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化開始于Baba［14］在1986年的研究，他通過 PEG 的介導(dǎo)將農(nóng)桿菌原生質(zhì)球與水稻原生質(zhì)體進(jìn)行融合，獲得的愈傷組織可以合成胭脂堿。隨后，大量有關(guān)水稻遺傳轉(zhuǎn)化的研究開始進(jìn)行，并不斷地深入。直至1994年，Hiei 等［15］首次實(shí)現(xiàn)了對粳稻的轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率高達(dá) 28.6%，并從分子水平上證明了外源基因已經(jīng)插入到水稻基因組中，且可以穩(wěn)定地遺傳，此研究取得了重大的技術(shù)突破，為近 20 年來水稻的研究發(fā)展奠定了堅(jiān)實(shí)的試驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。吳振映等［16］利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將編碼Bt毒性蛋白的 cry2A*基因轉(zhuǎn)入受體水稻品種鎮(zhèn)稻 88 中，PCR 和 AGE 分析結(jié)果表明，外源基因 cry2A*已成功整合到鎮(zhèn)稻 88 基因組內(nèi)，田間試驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因陽性植株有明顯的抗蟲效果。王春萍等［17］通過農(nóng)桿菌 LBA4404 將目的基因肌醇多磷酸鹽激酶基因 ThIPK2 轉(zhuǎn)入秈稻科恢 675 中，并建立了快速的遺傳轉(zhuǎn)化體系，經(jīng) PCR 檢測證實(shí)外源基因已成功轉(zhuǎn)入到科恢 675 中。周融希［18］通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將從小麥中克隆得到的小麥顆粒結(jié)合型淀粉合成酶基因 GBSSⅠ 轉(zhuǎn)入玉米自交系 Y423 體細(xì)胞胚胎中，獲得了轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng) PCR 檢測有 35 株呈陽性，陽性率為 15%。

3 影響根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物的問題

從根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的機(jī)理與過程中可看出，農(nóng)桿菌及單子葉植物這兩個方面的因素是決定根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物成功與否的關(guān)鍵。

3.1 根癌農(nóng)桿菌的相關(guān)因素

根癌農(nóng)桿菌對植物細(xì)胞的吸附是轉(zhuǎn)化的首要步驟。選擇合適的農(nóng)桿菌菌株與高效的表達(dá)載體是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化中至關(guān)重要的因素。農(nóng)桿菌的吸附數(shù)目越多轉(zhuǎn)化成功的可能性就越高，其與農(nóng)桿菌本身的性質(zhì)有密切關(guān)系。有研究表明，胭脂堿型農(nóng)桿菌比章魚堿性農(nóng)桿菌更易于附著在禾谷類細(xì)胞的表面［19］。

易自力［20］對供試水稻進(jìn)行平均瞬時表達(dá)率和穩(wěn)定表達(dá)率分析發(fā)現(xiàn)，EH105 分別為51.5%和28.4%，LBA4404分別為44.3%和22.6%，AGL1 分別為 39.8% 和 17.3%?？梢?，EH105 的轉(zhuǎn)化效果最好，LBA4404 的次之，AGLI 的最差。該試驗(yàn)表明，不同的農(nóng)桿菌菌株對水稻愈傷組織的轉(zhuǎn)化能力不同。劉香利［6］分別使用農(nóng)桿菌菌株 EHA105 和 LBA4404 侵染兩個小麥品種的幼胚愈傷組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對于菌株 EHA105，兩個小麥品種最佳侵染條件為農(nóng)桿菌侵染濃度為 OD600=0.8，侵染時間為 30 min；對于 LBA4404，綿陽 19 和洛陽 8716 的侵染最佳條件分別為 OD600=1.0，侵染 30 min 和 OD600=0.8，侵染 60 min。通過 gus 基因瞬時表達(dá)檢測對轉(zhuǎn)化率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，洛陽 8716 對 LBA4404 的敏感性高于綿陽 19，EHA105 對兩個品種侵染率都較高，這可能與其毒性較強(qiáng)有關(guān)。

3.2 單子葉植物的相關(guān)因素

3.2.1 基因型 與雙子葉植物一樣，單子葉植物受體品種的生理狀態(tài)與遺傳背景是影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的重要因素。易自力［20］的研究還得到另外一個結(jié)論：不同的水稻品種對農(nóng)桿菌的敏感性也是有差別的。梗稻品種臺北 309 對 3 種菌株的平均瞬時表達(dá)率和穩(wěn)定表達(dá)率分別為 55.5% 和 27.5%，而釉稻品種特青則分別只有 34.8% 和 18.0%。顯然，臺北 309 比特青更容易接受農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化，秈稻的轉(zhuǎn)化效率明顯低于粳稻。這主要是由于不同的水稻品種對農(nóng)桿菌侵染反應(yīng)的敏感性差異及其愈傷組織的誘導(dǎo)和分化能力的不同等諸多因素綜合影響導(dǎo)致的。

葉興國等［21］對我國 35 個春小麥進(jìn)行了農(nóng)桿菌敏感性研究和轉(zhuǎn)化研究發(fā)現(xiàn)，品種新春 9 號和 PM97034 兩個基因型對農(nóng)桿菌敏感性較強(qiáng)且轉(zhuǎn)化效率較高。王宏偉［22］在利用農(nóng)桿菌對玉米自交系 R18-599 和齊 319 幼胚愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化時發(fā)現(xiàn)，EHA105 菌株對玉米自交系齊 319 的侵染效果好于 R18-599，其平均 GUS 瞬時表達(dá)率分別為 31.2% 和 23.74%，說明基因型對玉米遺傳轉(zhuǎn)化效率有很大影響。李欣等［23］以 12 個優(yōu)良小麥新品種為材料，研究了各品種成熟胚的再生率及其對農(nóng)桿菌侵染的敏感性差異。結(jié)果顯示，周麥 27 和揚(yáng)麥 19 等品種成熟胚再生率比較高，適合進(jìn)行成熟胚培養(yǎng)，周麥 18 和揚(yáng)麥 15 等品種成熟胚愈傷組織對農(nóng)桿菌侵染比較敏感，適合進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。

3.2.2 外植體 不同的外植體意味著其細(xì)胞生長狀態(tài)、生活時期、生理代謝及基因表達(dá)都存在一定程度上的差異，因而不同生理狀態(tài)下的細(xì)胞對農(nóng)桿菌的敏感性及農(nóng)桿菌對該受體植物的感染性都不同。在農(nóng)桿菌侵染受傷植物時，受傷細(xì)胞會分泌酚類化合物激活農(nóng)桿菌 Ti 質(zhì)粒上的毒性區(qū)，以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化。有些研究者則認(rèn)為單子葉植物不能被農(nóng)桿菌所轉(zhuǎn)化是由于不能分泌酚類化合物或者分泌量不足。但 1996 年，許東暉［24］從水稻幼穗分化期和抽穗揚(yáng)花期的葉片抽提液中檢測到了與乙酰丁香酮的誘導(dǎo)作用相似的兩種酚類化合物信號分子，證實(shí)了單子葉植物含有高效誘導(dǎo) Vir 基因表達(dá)的信號分子，只是這類信號分子不能在植物微管系統(tǒng)內(nèi)運(yùn)輸，僅能在植物特定的發(fā)育時期和特定的部位細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生。同時，轉(zhuǎn)基因植物的再生決定于植物細(xì)胞的分化能力。因此，選擇適合轉(zhuǎn)化的最佳外植體對提高農(nóng)桿菌侵染單子葉植物的轉(zhuǎn)化效率，以及轉(zhuǎn)基因植株的獲得具有很大作用。王永勤等［25］研究發(fā)現(xiàn)，大于 10 d 齡的農(nóng)大愈傷組織作為轉(zhuǎn)化的起始材料，獲得抗性愈傷組織率比直接剝離的幼胚作為轉(zhuǎn)化受體的抗性愈傷率高 40.4%。馬建華等［26］采用攜帶雙元表達(dá)載體 PCAMBIA-1303 的根癌農(nóng)桿菌菌株 AGL1，對 12 個“川農(nóng)”系列小麥品種的幼胚和愈傷進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化，GUS 瞬時表達(dá)檢測結(jié)果表明，愈傷組織的瞬時轉(zhuǎn)化率明顯高于幼胚。這可能是由于愈傷組織的結(jié)構(gòu)和生理狀態(tài)更利于外源基因通過農(nóng)桿菌侵染整合到受體基因組。

4 提高根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物效率的對策

根據(jù)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的轉(zhuǎn)化機(jī)理，可以總結(jié)出以下幾個途徑是轉(zhuǎn)化過程的重要因素：（1）增加農(nóng)桿菌對受體植株的吸附量與相互作用；（2）對單子葉植物進(jìn)行受傷處理；（3）提高能活化vir基因表達(dá)的酚類物質(zhì)含量以造成對受體植物細(xì)胞的侵染；（4）加強(qiáng)T-DNA進(jìn)入植物細(xì)胞后，對植物基因組的整合度。因而，通過這些關(guān)鍵步驟的改良，使T-DNA能夠順利與植物基因組進(jìn)行整合并得以表達(dá)，是提高根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物效率的有效解決方法。

4.1 添加表面活性劑

表面活性劑具有離子型表面活性劑和非離子型表面活性劑，由于非離子活性劑對植物傷害性較小，毒性最弱，因而普遍應(yīng)用于生物研究領(lǐng)域中。表面活性劑有兩個主要特征：一是表面活性劑分子具有雙親結(jié)構(gòu)，對有機(jī)物具有較強(qiáng)的親和力；二是表面活性劑分子在較低濃度下就能吸附在兩相界面上，明顯降低界面張力，使高分散系統(tǒng)趨于穩(wěn)定［27］。

表面活性劑具有增加細(xì)胞膜通透性的功能，因而在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化過程中，能夠增加農(nóng)桿菌對植物的吸附，提高 T-DNA 從農(nóng)桿菌向植物細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的速度，從而獲得較高的轉(zhuǎn)化效率。早在Cheng［4］首次報道利用農(nóng)桿菌侵染獲得轉(zhuǎn)基因小麥的研究中就對表面活性劑對轉(zhuǎn)化的作用加以分析，認(rèn)為添加適宜濃度的 Silwet 和 Pluronic F-68 對農(nóng)桿菌侵染小麥以及外源基因的轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用，而 Tween20 和 Triton X 兩種表面活性劑以很低的濃度存在于共培養(yǎng)液中也會對受體小麥幼胚愈傷組織造成一定危害。隨后，有關(guān)表面活性劑在農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物的研究越來越深入。Yang等［28］在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米幼胚愈傷組織時，在菌液中添加 0.01%-0.02% Silwet L-77，最利于對玉米幼胚進(jìn)行轉(zhuǎn)化。王志成等［29］對農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻的方法進(jìn)行了改進(jìn)發(fā)現(xiàn)，在愈傷組織經(jīng)農(nóng)桿菌侵染后，再以 0.1% 表面活性劑 Tween20 的溶液進(jìn)行處理可明顯提高水稻愈傷組織的轉(zhuǎn)化頻率，也可相應(yīng)增加抗性植株的再生頻率。Chhabra 等［30］的研究發(fā)現(xiàn)，在農(nóng)桿菌侵染液中加入 0.2% Tween20 能提高農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化小麥愈傷組織的轉(zhuǎn)化效率，一旦高于這個濃度，轉(zhuǎn)化植株的 GUS 瞬時表達(dá)率就會急劇下降。

4.2 超聲波處理

超聲波處理主要通過超聲波的生物學(xué)效應(yīng)使細(xì)胞膜經(jīng)空化作用發(fā)生損傷，并且在超聲波處理過程中，液相介質(zhì)中會形成大量的小氣泡，這些小氣泡達(dá)到一定大小后就會爆裂，爆裂時產(chǎn)生的震動波或引起的介質(zhì)快速運(yùn)動足以對細(xì)胞和大分子物質(zhì)造成機(jī)械損傷。因此，在組織表面和細(xì)胞膜上會形成大量的微傷口［27］，增加了農(nóng)桿菌感染植物組織的深度，有利于提高轉(zhuǎn)化效率。但是超聲波會產(chǎn)生熱化作用，超聲在介質(zhì)中傳播時產(chǎn)生的能量會使介質(zhì)的溫度升高，對植物體造成傷害［27］。因此，超聲波處理的時間及強(qiáng)度需要適宜，處理過度會對植物轉(zhuǎn)化后的再生培養(yǎng)產(chǎn)生影響，處理強(qiáng)度和時間不足則對轉(zhuǎn)化效率無明顯作用效果。在研究中，對強(qiáng)度及時間等參數(shù)進(jìn)行討論分析，選擇最佳的處理?xiàng)l件是超聲波輔助農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法最重要的環(huán)節(jié)。

陳立國等［31］利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將 BG2 基因和 GUS 基因?qū)氲搅扼w普通小麥山農(nóng) 2618 的成熟胚愈傷組織中，研究表明運(yùn)用超聲波處理或真空處理可以提高轉(zhuǎn)化效率，最高轉(zhuǎn)化率可達(dá) 8.1%。王旭明等［32］利用超聲波對發(fā)芽的小麥種子處理 20 min 后再經(jīng)農(nóng)桿菌侵染，侵染后的種子正常播種管理至結(jié)實(shí)，對收獲的成熟種子進(jìn)行卡那霉素抗性篩選，4個受試小麥品種均得到抗性后代，PCR 檢測呈陽性，GUS 染色結(jié)果顯示未經(jīng)超聲波處理的種子幾乎看不到轉(zhuǎn)化細(xì)胞，而經(jīng)過超聲波處理的種子幼苗基部的細(xì)胞轉(zhuǎn)化成功，明顯提高了轉(zhuǎn)化效率。

4.3 添加抗氧化劑

在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物時，共培養(yǎng)階段愈傷組織會出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，影響組織分化，不利于農(nóng)桿菌對受體材料的轉(zhuǎn)化。有些研究發(fā)現(xiàn)這是由于農(nóng)桿菌的侵染對植物細(xì)胞造成逆境環(huán)境，植物細(xì)胞在這種逆境下會產(chǎn)生大量的過氧化物，細(xì)胞因此發(fā)生氧化脅迫現(xiàn)象。而抗氧化物可以去除細(xì)胞內(nèi)的活性氧成分，保護(hù)細(xì)胞的碳水化合物、蛋白質(zhì)及 DNA 等物質(zhì)不被氧化，從而減少愈傷組織培養(yǎng)過程中的褐化，利于受體材料的再生。因此，近年來，通過添加抗氧化劑提高單子葉轉(zhuǎn)化效率的研究成為熱點(diǎn)，相關(guān)報道也較豐富。

于惠敏等［33］在利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化濟(jì)南 177 小麥的胚性愈傷組織的研究中，探討了抗氧化劑二硫蘇糖醇（DTT）和聚乙烯聚吡咯烷酮（PVP）對小麥轉(zhuǎn)化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)過程中添加 DTT 和 PVP 對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥轉(zhuǎn)化有一定的促進(jìn)作用，當(dāng) DTT 的含量達(dá)到 0.1%-0.15%，PVP 含量達(dá)到 1.0% 時，這種促進(jìn)作用最為明顯，并且 DTT 對轉(zhuǎn)化的促進(jìn)作用明顯優(yōu)于 PVP，而且用量小。除了這兩種抗氧化劑以外，還有半胱氨酸（Cys）、抗壞血酸（Vc）、谷胱甘肽（GSH）及 AgNO3等都可消除活性氧，其中 AgNO3的應(yīng)用較為普遍。AgNO3作為一種強(qiáng)還原劑，對防止組織褐化具有明顯的作用。王秀紅等［34］在對影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化玉米相關(guān)因子的研究中發(fā)現(xiàn)，愈傷組織誘導(dǎo)率會隨著培養(yǎng)基中添加的 AgNO3濃度的增加而升高，AgNO3的添加量以 5.0 mg/L 時的愈傷組織誘導(dǎo)效果最好，愈傷誘導(dǎo)率最高，達(dá)94.3%；在培養(yǎng)中還發(fā)現(xiàn)，AgNO3能減緩褐色物質(zhì)的分泌，使培養(yǎng)基保持透明；篩選培養(yǎng)時，與未添加的 AgNO3的培養(yǎng)基上的胚性愈傷率相比，添加 5.0 mg/L AgNO3的培養(yǎng)基上胚性愈傷率增加了 37.2%，由此可見，AgNO3的添加對增加農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米的轉(zhuǎn)化效率有明顯作用。喬定君等［35］通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化多年生黑麥草時，在預(yù)培養(yǎng)及共培養(yǎng)基中添加 0.1 mol/L 甘露醇或 5 mg/L AgNO3，添加 0.1 mol/L 甘露醇或 5 mg/L AgNO3或 0.1 mol/L 甘露醇+ 5 mg/L AgNO3，轉(zhuǎn)化效率分別為對照的 1.96、1.59 和 2.95 倍。結(jié)果表明，在根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的多年生黑麥草愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化中，在預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)基中添加甘露醇或AgNO3能提高轉(zhuǎn)化率，且當(dāng)二者共同添加時，可顯著提高轉(zhuǎn)化率。

4.4 添加乙酰丁香酮

乙酰丁香酮（AS）是農(nóng)桿菌毒力基因 Vir 的誘導(dǎo)物。單子葉植物AS的分泌量較少或是不足以完成農(nóng)桿菌毒性基因的激活，因而在轉(zhuǎn)化中添加適量的AS成為解決這一問題的方法之一。隨著對S提高植物遺傳轉(zhuǎn)化率的作用機(jī)理、影響因素的研究，AS被廣泛應(yīng)用于植物基因工程中，尤其是在單子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化研究領(lǐng)域，并取得了不錯成效。

Wu等［36］將攜帶輔助質(zhì)粒（VirG、VirB和VirC基因）的農(nóng)桿菌菌株AGL1，重懸于添加有 400 μmol/L AS 的CM4C液體培養(yǎng)基中，對四倍體硬粒小麥的新鮮幼胚進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲得了 0.6%-9.7% 的轉(zhuǎn)化率。并于次年，對春小麥和冬小麥新鮮幼胚進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率達(dá) 0.3%-9.0%［37］。李明浩等［38］通過檢測農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的揚(yáng)麥15和Alondra’s的幼胚愈傷組織的 gus 基因瞬時表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)AS的濃度對于小麥愈傷組織gus基因的瞬時表達(dá)率有重要影響，加入AS后的gus基因的瞬時表達(dá)率較未添加時有顯著提高，并且當(dāng)濃度過大時會不利于轉(zhuǎn)化，AS的濃度以100 μmol/L為宜。徐書舉等［39］以優(yōu)良玉米自交系丹598、鄭58、昌7-2、掖478 的莖尖為受體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將抗旱基因 SAMS 轉(zhuǎn)入玉米對轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行檢測共獲得陽性植株35株，表明基因已經(jīng)整合到玉米基因組中，同時對乙酰丁香酮對轉(zhuǎn)化的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，當(dāng)菌液中AS的添加量為100 μmol/L 時轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高，比未添加AS 的轉(zhuǎn)化率高 2.6%，但當(dāng)AS濃度過高時，由于對其莖尖毒性增強(qiáng)，轉(zhuǎn)化率反而下降，可見，在農(nóng)桿菌侵染液中添加一定量的AS，可以明顯地提高莖尖的轉(zhuǎn)化率。

5 結(jié)語

經(jīng)過眾多學(xué)者長期的研究，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)單子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化機(jī)理逐漸深入，技術(shù)方法不斷創(chuàng)新、改良和完善，轉(zhuǎn)化影響因子逐步探討與優(yōu)化，各方面都取得了長足進(jìn)展。但是，與農(nóng)桿菌介導(dǎo)雙子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化研究相比，對單子葉植物在該方面的研究還有較大的差距，目前還存在較多問題，諸如轉(zhuǎn)化率還不高，研究范圍較局限，分子生物學(xué)證據(jù)不充分等。因此，今后農(nóng)桿菌介導(dǎo)單子葉植物的研究還需進(jìn)一步加強(qiáng)對轉(zhuǎn)化機(jī)制的認(rèn)識，尤其是在分子水平對其深入探討，確定T-DNA轉(zhuǎn)移過程的信號定位以及外源目的基因的定點(diǎn)插入等分子機(jī)理；同時從分子生物學(xué)的角度對農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化步驟中，影響轉(zhuǎn)化率的相關(guān)因素的主要作用進(jìn)行更科學(xué)完善的分析；其次，對外源基因在轉(zhuǎn)基因植株后代中的遺傳情況進(jìn)行鑒定，在遺傳學(xué)方面給予更充分的科學(xué)憑證。

近年來，一些與農(nóng)桿菌介導(dǎo)法相結(jié)合的轉(zhuǎn)化方法相繼產(chǎn)生、發(fā)展，并取得了一定效果。如花序浸泡法等，不僅簡化了農(nóng)桿菌侵染的復(fù)雜步驟，而且也在一定程度上提高了轉(zhuǎn)化效率，但這些方法應(yīng)用還不十分廣泛，需要進(jìn)一步的完善與發(fā)展。在單子葉植物研究范圍方面還缺乏廣泛性，受體植物品種較少，種類局限，大部分研究都是圍繞在禾本科農(nóng)作物，在今后的研究中，可以擴(kuò)大研究對象范圍，增加并豐富農(nóng)桿菌介導(dǎo)單子葉植物的科學(xué)依據(jù)。

長期以來，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的單子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化都基于實(shí)驗(yàn)室理論研究，實(shí)踐應(yīng)用還不廣泛，利用有價值的單子葉植物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得目的基因的表達(dá)產(chǎn)物以應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)或是畜牧業(yè)發(fā)展都具有重要的經(jīng)濟(jì)商業(yè)價值。相信隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的快速發(fā)展，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)獲得的單子葉植物轉(zhuǎn)基因新種質(zhì)將會越來越多，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品資源將會日益豐富。

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