產細菌素乳酸菌篩選方法的研究進展*

侯亞文，易華西，楊艷艷，張?zhí)m威，馬放

1(哈爾濱工業(yè)大學食品科學與工程學院，黑龍江哈爾濱，150090)2(哈爾濱工業(yè)大學市政環(huán)境工程學院，黑龍江哈爾濱，150090)

近年來，利用乳酸菌對食品中一些腐敗菌和致病菌的抑制作用來加強食品安全性和延長貯存期的生物保藏法逐漸被食品工業(yè)所重視［1］。乳酸菌在代謝過程中可以產生許多抑菌物質，其中細菌素(抗菌肽)是乳酸菌產生的一類分子質量小、無毒、具有抑菌活性的蛋白質或多肽。隨著對細菌素作用機制及抗菌潛力的不斷挖掘，建立一個產細菌素乳酸菌的快速、高效的高通量篩選平臺是目前國內外面臨的技術難題。截至目前，細菌素的篩選多數來自發(fā)酵食物中的微生物菌群，而我國作為乳酸菌資源十分豐富的國家，為挖掘潛在的、具有我國自主知識產權的新型細菌素及乳酸菌菌株提供了重要渠道。除了nisin和pediocin PA-1之外，對其他乳酸菌細菌素還沒有進行很好的大規(guī)模生產和開發(fā)性研究［2］。由于建立在乳酸菌生物信息學方面的基礎研究不斷發(fā)展，目前大多數快速篩選手段都是基于乳酸菌編碼細菌素的基因序列設計特定引物，利用PCR方法實現快速篩選［3］。該方法與傳統(tǒng)的瓊脂擴散培養(yǎng)法相比，具有特異性強，大大縮短了篩選周期等優(yōu)點。本文比較綜述了目前已經報道的產細菌素乳酸菌的篩選方法，期望為我國乳酸菌細菌素的發(fā)掘乃至我國生物防腐劑的開發(fā)與應用提供參考。

1 瓊脂擴散法

瓊脂擴散法是利用待檢測菌在瓊脂表面對指示菌的生長顯示抑制效果的一種定性分析抑菌譜的篩選方法，是Tramer等人1964年建立起來的，適用于不透明、不能使用濁度分析法分析的樣品［4］。常用的杯碟法(well test)，濾紙片法(disc diffussion)和點種法(spot inoculation)均屬于此類方法。Wolf和Gibbons［5］對瓊脂擴散法進行了改進，在培養(yǎng)基中加入吐溫20或吐溫80加快抗菌肽在瓊脂中的擴散，提高了其靈敏度和準確性。目前，國內外大多數產抗菌肽乳酸菌的篩選均建立在該方法的基礎上，Nabil Ben利用瓊脂擴散法在當地發(fā)酵食品中進行產抗菌肽乳酸菌的初篩，從135株乳酸桿菌篩選出31株產抗菌肽的乳酸菌，經鑒定為28株植物乳桿菌和3株發(fā)酵乳桿菌［6］。Svetoslav利用瓊脂擴散法從一種植物中分離出1株具有抗乳酸菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯氏菌、李斯特菌諾克(Listeria innocua)、李斯特菌伊萬諾夫(Listeria ivanovii)、單核細胞增生李斯特氏菌等致病菌的戊糖片球菌ST44AM，所產生的細菌素經鑒定為片球菌素PA-1，它是一種ClassⅡ型細菌素［7］。胡淑敏利用的牛津杯雙層平板法也屬于此類篩選方法［8］，他從70株乳酸菌中篩選得到2株具有較高抑菌活性的乳酸菌LAB30和LAB211。黃新鳳(2009)等通過抑菌法從生牛奶中篩選出1株對多種G+細菌、G-細菌、酵母菌和絲狀真菌的乳酸乳球菌乳酸亞種菌株(Lactococcus lactis subsp.lactis)，并命名為 MB191［9］。

一種乳酸菌可能產生一種或多種細菌素，但由于最佳條件難以控制，很難兼顧細菌生長活力和所產細菌素活力同時保持最佳狀態(tài)，或者篩選出了高產細菌素而無法發(fā)現其潛在的性能更加穩(wěn)定的細菌素。因而利用瓊脂擴散法進行產抗菌肽乳酸菌篩選的同時還應考慮培養(yǎng)基的優(yōu)化。李秀涼等人利用RSM法優(yōu)化了副干酪乳桿菌HD17產細菌素的發(fā)酵培養(yǎng)基，找到了最大細菌素產生區(qū)域進而確定了培養(yǎng)基最佳配方［10］。Amelia等人研究并評價了一些環(huán)境因素對植物乳桿菌17.2b產細菌素的影響，發(fā)現植物乳桿菌17.2b產細菌素的條件對環(huán)境條件十分敏感，與細菌生長并沒有關系，細菌素產量達到最大時選擇次優(yōu)增長溫度(suboptimal growth temperatures)，pH值選擇高于最適生長時的pH值，不需要NaCl［11］。最近的研究表明，一些乳酸菌產細菌素的能力除了與環(huán)境因素有關，還與培養(yǎng)基中NaCl濃度和有無表面活性劑有關。Castro等人發(fā)現發(fā)酵干腸中分離出的乳酸菌在冷藏條件下添加3%的NaCl，以及表面活性劑吐溫20和聚氧乙烯脂肪醇醚35，有利于乳酸菌產出熱穩(wěn)定性強的乳酸菌素［12］。

瓊脂擴散法具有操作簡單、結果直觀等優(yōu)點，同時也具有準確性、重復性差等缺點，很難作為高通量的篩選方法。本課題組將瓊脂擴散法作為我們開發(fā)的PCR快速篩選方法的輔助驗證手段，使結果更加準確可靠。目前雖然陸續(xù)有很多快速篩選方法的報道，但是瓊脂擴散法仍然是國內外最普遍使用的方法，還沒有出現一種篩選方法能完全代替瓊脂擴散法。

2 微孔板生物測定法

微孔板生物測定法是Berridge和Barret在1952年提出的另一種基于抑菌活性的半定量篩選方法，基本原理是根據菌體濃度在一定范圍內與透光度之間存在線性關系，確定存在線性關系的菌體濃度范圍(或透光度范圍)，從而建立起菌體濃度(Log10C)和透光度(T%)的線性關系［13］。Bhunia等人采用了96孔板法測定發(fā)酵上清液中細菌素的活性，其本質是通過連續(xù)的梯度稀釋，找到最低抑制濃度或50%抑制濃度，然后以這個濃度作為任意單位，通過稀釋倍數來計算原溶液中細菌素的效價［14］。Turcotte等對這種多孔平板法作了改進，對指示菌的濃度和培養(yǎng)時間進行了優(yōu)化，改變了多孔平板法作為一種半定量方法的局限性。研究表明，96孔板法的檢測極限(0.08～60 μg/mL)是瓊脂擴散法(0.3 ～10 μg/mL)的 4 ～6倍［15］。

借助于酶標儀，多孔平板法操作起來簡便快捷、省時、省力以及精密準確而使其在產細菌素乳酸菌的篩選方面被廣泛應用。但是，筆者研究發(fā)現由于裝有指示菌液的多孔平板必須在培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)12～24 h，多孔平板孔洞中的菌液不可避免會揮發(fā)，在平板孔蓋上方容易產生水蒸氣，一方面改變了孔洞里的原始菌液體積，另一方面影響了比色結果，不能十分精確地測定細菌素的濃度;若稀釋倍數產生±1的偏差，會導致估算的原溶液細菌素的效價產生2倍甚至更大的偏差。后來對其進行了改進，一方面在培養(yǎng)箱中墊放濕紗布或濕海綿盡量減少培養(yǎng)過程中菌液的揮發(fā)，同時在培養(yǎng)完畢后補加培養(yǎng)液，盡量減少誤差。

3 生物熒光法

生物熒光是活的生物組織體內由于代謝活動產生的一種發(fā)光現象。將編碼熒光素酶的基因克隆到指示菌中，可用于抗菌作用的敏感性檢測。利用細菌的熒光素酶基因克隆到金黃色葡萄球菌，大腸桿菌和沙門氏菌等指示菌中，使得指示菌具有熒光酶基因luxAB和負責合成長鏈脂肪醛的luxCDE基因，用于產生熒光，不需要外源性醛的加入就可以使熒光穩(wěn)定產生，無需平板計數和過夜培養(yǎng)就可以快速檢測出抗菌作用。該方法已經用于檢測乳酸菌的抗菌作用［16］。另外，Norma等人研究了一種基于黃連素流入受損細胞后的熒光放射新型細菌素篩選方法［17］。黃連素是一種位于細胞內的發(fā)熒光的生物堿，盡管這種特性的機制還不是很清楚，但它與生物分子包括DNA和葡糖胺多糖相結合時能發(fā)出熒光已經得到確認。黃連素分子量小于ATP，可以通過氣孔或者細胞質膜破裂后進入細胞［18-19］。鑒于此，由細菌素導致的細胞膜破壞會引起黃連素的細胞內定位，同時使細胞發(fā)出熒光。因此，該方法的研究可以用來篩選作用機制為形成膜孔或破壞細胞膜完整性的產細菌素的乳酸菌。

生物熒光法具有快速、準確等優(yōu)點，可以在1～2 h內得到結果。但這種方法的前提是必須先構建含有熒光酶基因的基因重組指示菌菌株，技術要求較高，雖然從理論上這種方法可作為篩選產細菌素乳酸菌的快速甚至高通量檢測方法，但由于指示菌種類(食品腐敗菌或致病菌)繁多，實際上不可能一一構建所有的指示菌重組菌株，這種方法不適于用來篩選產廣譜細菌素的乳酸菌。

4 基于PCR技術的快速篩選方法

隨著在世界范圍內對不同乳酸菌菌株基因組測序的完成，基因組序列在挖掘新型高效的細菌素方面扮演著重要的角色，使得利用生物信息學的方法預測和尋找新型細菌素成為可能。根據已知的細菌素DNA序列設計保守的PCR引物或制備寡核苷酸探針，可以在大范圍內的乳酸菌群中挖掘出依賴功能性測定時不易發(fā)現的細菌素［20］。其中，基于PCR方法的快速篩選可以作為生態(tài)學研究中的有效手段，可以鑒定出產細菌素的益生菌，并將其應用在食品工業(yè)中。Michat等人基于class IIa型細菌素編碼基因，設計了編碼class IIa細菌素基因的7對引物，利用PCR方法從40種奶酪樣品中篩選出了產class IIa細菌素的乳酸菌［21］。Sunita等人用各種引物的PCR陣列鑒定出了LAB Bac+結構基因，結果表明細菌素PCR陣列可以成功地擴增來自乳酸桿菌、乳球菌以及片球菌中的細菌素結構基因［23］，該研究建立了一種微平板細菌素PCR陣列，可以快速擴增細菌素結構基因。另外，建立在PCR方法上的快速篩選還可以用來分析乳酸菌細菌素的基因簇多樣性，而基因簇的多樣性或操縱子的多態(tài)性可以反映細菌素是否具有廣譜抗菌性。Nabil等人利用PCR方法研究了已報道的產細菌素植物乳桿菌，對植物乳桿菌素操縱子的基因圖譜進行了研究，用特定引物PCR擴增，將擴增產物用于HindIII，EcoRI和KpnI的限制性群集分析，發(fā)現了植物乳桿菌C11中含有若干個植物乳桿菌素基因，而發(fā)酵乳桿菌EC11包含了plnDEFG基因簇［24］。我們課題組根據ClassⅡa抗菌肽N-端保守氨基酸序列(-YGNGVCXXXXCXV-和-LDNAIE-)這一特征設計簡并引物，建立了基于 Colony-PCR法的產ClassⅡa抗菌肽乳酸菌的快速篩選方法，結合瓊脂擴散法，能夠快速有效地從復雜的環(huán)境中分離出產細菌素的乳酸菌［22］。

基于PCR技術的篩選方法具有靈敏、快速、簡單等優(yōu)點，目前被視為最有可能代替?zhèn)鹘y(tǒng)瓊脂擴散法的方法，但由于所利用的特異性引物均為兼并引物，PCR擴增很難避免非特異性產物，有時甚至出現非特異性產物濃度高于特異性目標產物，雖然我們在研究中對引物和PCR反應條件都進行了優(yōu)化，但有時仍然會出現擴增產物濃度過低難以回收的情況。究其原因，還是特異性靶點過少或特異性不強，需要進一步增加特異性靶點挖掘的廣度和深度。隨著乳酸菌代謝產物及其編碼基因等生物信息的豐富，利用生物信息學方法從蛋白質水平和基因水平進一步挖掘特異性靶點，有望建立基于PCR技術的產ClassⅡa細菌素乳酸菌的高通量篩選模型，為構建基于我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品宏基因組學的ClassⅡa抗菌肽高通量篩選平臺奠定基礎。

5 其他方法

在過去的20多年中，許多新方法也被用來篩選產細菌素的乳酸菌，但由于存在的弊端和不足并沒有被廣泛應用，例如基于多克隆或單克隆抗體的免疫學檢測方法ELISA，雖然該方法具有很高的靈敏性，但由于測定的結果與抗菌活力并沒有直接相關性，同時抗體與相關物質的交叉反應很難避免，所以依賴于抗體技術的免疫學檢測法還有待于抗體的改進和發(fā)展。此外，如 ATP生物熒光法 (ATP-bioluminometry)［25］、輻射線法(radiometry)［26］、電導率測定法 (conductancemeasurement)［27］、毛細管區(qū)帶電泳法 (capillary zonal electrophoresis)［28］、血細胞計數法 (flowcytometry)［29］也有報道。但是這些方法并沒有被廣泛地應用，其原因主要是因為操作復雜、特異性不強，而且需要專用的儀器和設備。

6 展望

我國是一個乳酸菌資源十分豐富的國家，但對乳酸菌素的研究起步較晚，除nisin外，對其他乳酸菌細菌素還沒有進行很好的基礎和開發(fā)性研究。為了對細菌素活性及分離純化進一步研究，尋找快速、有效的高通量篩選平臺至關重要，同時也成為目前如何獲取新型廣譜乳酸菌細菌素的瓶頸問題之一。為了避免傳統(tǒng)瓊脂擴散篩選方法篩選耗時長的缺點，近些年的研究多數建立在生物信息學方法的基礎上。由于乳酸菌所產細菌素的分子量比較小，抗菌肽編碼基因的cDNA片段較小，通常僅有幾百bp，有的甚至只有幾十bp，給抗菌肽基因工程操作帶來極大困難［30］。另外，抗菌肽基因非常小，實驗室一般的質粒檢測和PCR檢測的方法對于驗證表達載體很困難。對于上述難題，最新研究表明可通過基因重組的手段構建雜合子，或者采用誘變育種的手段以期獲得新型的廣譜細菌素［31-32］?？傊S著對乳酸菌基因組學的不斷發(fā)展和研究，基于生物信息學的PCR方法將成為快速發(fā)掘產細菌素乳酸菌的主要方向和策略，將為開發(fā)新型食品天然防腐劑奠定基礎。

［1］ Lucy H Deegan，Paul D Cotter，Hill C，et al.Bacteriocins:Biological tools for bio-preservation and shelf-life ex-tension［J］.International Dairy Journal，2006，16(9):1 058-1 071.

［2］ A Gálvez，H Abriouel，Lopez R L，et al.Bacteriocinbased strategies for food biopreservation［J］.International Journal of Food Microbiology，2007，120(1):51-70.

［3］ Adrian L Cookson，Samantha J Noel，Kelly W J，et al.The use of PCR for the identification and characterization bacterioc in genes from bacterial strains isolated from rumen or caecal contents of cattle and sheep［J］.FEMS Microbiology Ecology，2004，48(2):199-207.

［4］ Tramer R Y J.Antibiotics in milk［J］.Journal of the Society of Dairy Technology，1964，17(2):95-100.

［5］ Wolf C E，Gibbons W R.Improved method for quantification of the bacteriocin nisin［J］.Journal of Applied Bacteriology，1996，80(4)，453-457.

［6］ Nabil B O，Hikmate A，Keleke S，et al.Bacteriocin-producing Lactobacillus strains isolated from poto poto，a Congolese fermented maize product，and genetic fingerprinting of their plantaricin operons［J］.International Journal of Food Microbiology，2008，127(1-2):18-25.

［7］ Svetoslav D Todorov，Leon M T Dicks.Bacteriocin production by Pediococcus pentosaceus isolated from marula(Scerocarya birrea)［J］.International Journal of Food Microbiology，2009，132(2-3):117-126.

［8］ 胡淑敏，孔健，季明杰，等.產廣譜抗菌肽乳酸菌的篩選［J］.山東大學學報:理學版，2008，43(7):2-4.

［9］ 黃新鳳，江夢天，邵小虎，等.一株抗G-和酵母菌的乳酸乳球菌的分離鑒定與抗菌活性［J］.生物學通報，2009，39(9):1 356-1 362.

［10］ 李秀涼，陳建偉，張玉娟，等.利用RSM法優(yōu)化副干酪乳桿菌HD17產細菌素發(fā)酵培養(yǎng)基［J］.黑龍江大學自然科學學報，2008，25(5):621-624.

［11］ Amelia Delgado，Francisco Noe Arroyo Lopez，Brito D，et al.Optimum bacteriocin production by Lactobacillus plantarum 17.2b requires absence of NaCl and apparently follows a mixed metabolite kinetics［J］.Journal of Biotechnology，2007，130(2):193-201.

［12］ M P Castro，N Z Palavecino，Herman C，et al.Lactic acid bacteria isolated from artisanal dry sausages:Characterization of antibacterial compounds and study of the factors affecting bacteriocin production［J］.Meat Science，2011，87(4):321-329.

［13］ Berridge N J，Barret J.A rapid method for the turbidometric assay of antibiotics［J］.Journal of General Microbiology，1952，6(1/2):14-20.

［14］ Mortvedt C I，Nes I F.Plasmid associated bacteriocin production by a Lactobacillus sake strain［J］.Journal of General Microbiology，1990，136(8):1 601-1 607.

［15］ Carl Turcotte，Christophe Lacroix，Kheadr E，et al.A rapid turbidometric microplate bioassay for accurate quantification of lactic acid bacteria bacteriocins［J］.International Journal of Food Microbiology，2004，90(3):283-293.

［16］ Satu Vesterlund，Johanna Paltta，Laukova A，et al.Rapid screening method for the detection of antimicrobial substances［J］.Journal of Microbiological Methods，2004，57(1):23-31.

［17］ Norma de la Fuente-Salcido，Salcedo-Hernandez R，Alanis-Guzman MG，et al.A new rapid fluorogenic method for measuring bacteriocin activity［J］.Journal of Microbiological Methods 2007，70(1):196-199.

［18］ 楊全玉，李永生，高秀峰，等.黃連素標記的脫氧核糖核酸熒光毛細生物傳感器的研制及應用［J］.理化檢驗(化學分冊)，2008，44(6):491-494.

［19］ Sameer S Talwalkar，A B Vaidya，MD，et al.Plasmodium DNA fluoresces with berberine a novel approach for diagnosis of malarial parasites［J］.Microbiology and Infectious Disease，2005，124(3):408-412.

［20］ 易華西，張?zhí)m威，杜明，等.乳酸細菌素抗菌潛力挖掘研究進展［J］.中國食品添加劑，2009，12(1):73-76.

［21］ Michat Wieckowicz，Marcin Schmidt，Sip A，et al.Development of a PCR-based assay for rapid detection of class IIa bacteriocin genes［J］.Letters in Applied Microbiology，2011，52(3):281-289.

［22］ Yi Huaxi，Zhang Lanwei，Tuo Yanfeng，et al.A novel method for rapid detection of class IIa bacteriocin-producing lactic acid bacteria［J］.Food Control，2010，21(4):426-430.

［23］ Sunita J Macwana，Peter M Muriana.A‘bacteriocin PCR array’for identification of bacteriocin-related structural genes in lactic acid bacteria［J］.Journal of Microbiological Methods，2012，88(2):197-204.

［24］ Nabil Ben Omar. Bacteriocin-producing Lactobacillus strains isolated from poto poto，a Congolese fermented maize product，and genetic fi ngerprinting of their plantaricin operons［J］.International Journal of Food Microbiology，2008，127(1/2):18-25.

［25］ Waites M J，Ogden K.The estimation of nisinusing ATP bioluminometry［J］.Journal of the Institute，1987，93(1):30-32.

［26］ Culter R R，Wilson P，Clarke F V.Evaluation of a radiometric method for studying bacterial activity in the presence of antimicrobial agents［J］.Journal of Applied Bacteriol，1989，66(6):515-521.

［27］ Giraffa G，Neviani E，Veneroni A.Use of conductance to detect bacteriocinactivity［J］.Journal of Food Protection，1990，53(9):772.

［28］ Rossano R，Del Fiore A，D Elia A，et al.New procedure for the determination of nisin in milk［J］.Biotechnol Technique，1998，12(10):783.

［29］ Budde B B，Rasch M.Acomparative study on the use of flow cytometry andcolony forming units for assessment of the antibacterial effect of bacteriocins［J］.International Journal of Food Microbiology，2001，63(1):65-72.

［30］ 朱文淼，劉穩(wěn).乳酸菌細菌素的分子生物學研究進展［J］.中國微生態(tài)學雜志，2000，12(2):113-115.

［31］ Leonardo Acu?a，Gianluca Picariello.A new hybrid bacteriocin，Ent35-MccV，displays antimicrobial activity against pathogenic Gram-positive and Gram-negative bacteria［J］.FEBS Open Bio，2012(2):12-19.

［32］ Gyu-Sung Cho，Melanie Huch.Genetic analysis of the plantaricin EFI locus of Lactobacillus plantarum PCS20 reveals an unusual plantaricin E gene sequence as a result of mutation［J］.International Journal of Food Microbiology，2010，141:117-124.