應(yīng)用蛋白指紋圖譜篩選腫瘤壞死因子抑制劑治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的生物標(biāo)志物

史　群，林　瑋，胡朝軍，白伊娜，張　文，張奉春

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科，北京 100032)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性、炎性多關(guān)節(jié)病并導(dǎo)致進(jìn)展性的關(guān)節(jié)損傷和致殘。改善病情抗風(fēng)濕藥(disease modified antirheumatic drugs，DMARDs)的應(yīng)用可阻止RA患者關(guān)節(jié)炎性反應(yīng)和骨侵蝕，改善預(yù)后。以腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)抑制劑為代表的生物制劑，如依納西普[1-2]、英夫利西[3-4]和阿達(dá)木單抗[5]等屬于生物制劑類DMARDs，可有效抑制關(guān)節(jié)炎性反應(yīng)、改善預(yù)后。

盡管TNF抑制劑療效顯著，但仍有約20%的患者治療反應(yīng)不佳[2-3]。由于生物制劑在我國價格昂貴，故尋找可預(yù)測治療有效性及判斷療效的生物標(biāo)志物對正確合理應(yīng)用該類藥物有重要意義[6]。研究自身免疫性疾病的發(fā)病、病情和療效相關(guān)的生物標(biāo)志物的方法很多，其中蛋白指紋圖譜的表達(dá)是一種重要手段。關(guān)于RA生物治療的蛋白組學(xué)研究國外報道較少[7-9]，而檢索中國醫(yī)院數(shù)字圖書館，尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)文獻(xiàn)。本研究通過蛋白指紋圖譜篩選英夫利西單抗治療RA患者前后小分子蛋白的表達(dá)情況，為尋找可判斷TNF抑制劑有效性的生物標(biāo)志物提供一定依據(jù)。

對象和方法

研究對象

2010年至2011年北京協(xié)和醫(yī)院確診的RA患者17例，診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2010年美國風(fēng)濕病學(xué)會歐洲風(fēng)濕病學(xué)聯(lián)盟的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]；且傳統(tǒng)DMARDs治療效果不佳，按照RA疾病活動評分(disease activity score 28，DAS28)病情為中度和重度活動(DAS28>3.2)。該研究經(jīng)北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，每例患者均簽署知情同意書。

臨床療效評價

療效指標(biāo)包括腫脹關(guān)節(jié)數(shù)、觸痛關(guān)節(jié)數(shù)、紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate， ESR)、C反應(yīng)蛋白(C reactive protein，CRP)、DAS28、患者健康評估問卷(health assessment questionnaire，HAQ)。療效判斷根據(jù)DAS28下降分值，治療后DAS28下降≥30%者臨床判斷為有效，DAS28下降<30%者臨床判定為無效。

方法

給藥方法：治療第0、2、6、14、22周給予RA患者英夫利西單抗靜脈滴注，共5次，每次劑量200 mg。

血清樣品：留取患者治療前、治療14和26周的外周血標(biāo)本。所有標(biāo)本均采用4 ml無抗凝劑的BD真空采血管空腹采血后于4℃靜置1 h，4000×g離心5 min。血清分裝5管，于―80℃凍存?zhèn)溆?。弱陽離子(WCX)納米磁性微球，購自北京賽爾迪生物技術(shù)有限公司。乙腈、三氟乙酸、尿素、Hepes、水(HPLC級)、Tris堿、CHAPS、DTT、Sinapinic acid(SPA)購自Sigma公司。PBSII-C型蛋白質(zhì)芯片閱讀儀為美國賽弗吉公司產(chǎn)品。

標(biāo)本準(zhǔn)備：血清融化后4℃，20 000×g離心10 min。取10 μl血清，加20 μl的U9緩沖液(9 molL尿素、20 gL CHAPS、10 gL DTT、50 mmolL Tris-HCl、pH值9.0)，4℃振搖30 min后加入100 mmolL NaAc 370 μl(pH值4.0)，混勻。

統(tǒng)計學(xué)處理

采用Ciphergen ProteinChip軟件和BioMarker Wizard軟件對蛋白指紋圖譜進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。治療前后蛋白質(zhì)峰的比較采用t檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。蛋白質(zhì)峰值與臨床炎性指標(biāo)相關(guān)性采用Pearson相關(guān)系數(shù)進(jìn)行分析。

結(jié)　　果

英夫利西單抗治療前后RA患者一般資料及療效評估

納入本研究的17例RA患者均為女性，年齡 20～59歲，平均(43±12)歲；病程6～48個月，平均(25±21)月。所有患者治療前DAS28評分均為中至重度活動。治療前(第0周)、治療中(第14周)和治療后(第26周)主要臨床指標(biāo)見表1。治療后DAS28下降>30%者13例(76.5%)，臨床判斷為治療有效；4例(23.5%)患者DAS28下降<30%，臨床判定為療效不佳。

英夫利西單抗治療前后患者血清蛋白組學(xué)變化

治療后血清水平下降的小分子蛋白：治療有效的13例患者治療后血清蛋白組學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)共有10種小分子蛋白的血清水平下降，這10種小分子蛋白分別為mz 8209.4、mz 3303.6、mz 9014.3、mz 8688.2、mz 5851.0、mz 6917.6、mz 4340.5、mz 4514.9、mz 5056.1和mz 10 741.3(表2)。治療中(第14周)、治療后(第26周)與治療前(第0周)蛋白質(zhì)峰相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1A、C)。上述10種蛋白下降水平與DAS28、ESR和CRP下降呈平行關(guān)系，相關(guān)性分析具有正相關(guān)性。4例療效不佳者治療前(第0周)、治療中(第14周)和治療后(第26周)上述10種小分子蛋白的表達(dá)水平無顯著性變化(P>0.05)(圖1B、D)。

治療后血清水平上升的小分子蛋白：經(jīng)英夫利西單抗治療后檢測血清蛋白水平，發(fā)現(xiàn)所有17例患者均有2種小分子蛋白水平上升，分別為mz 5 382.4和mz 5 960.2(圖2)，治療前(第0周)、治療中(第14周)和治療后(第26周)上述蛋白表達(dá)水平的變化差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表3)。

表1　英夫利西單抗治療前后類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者主要臨床指標(biāo)改變Table 1　Comparison of clinical and laboratory parameters in rheumatoid arthritis patients before and after inflimimab treatment

DAS28：病情活動評分；ESR：紅細(xì)胞沉降率；CRP：C反應(yīng)蛋白；HAQ：健康評估問卷；w 0：治療前(第0周)；w14：治療中(第14周)；w26：治療后(第26周)

表2英夫利西單抗治療后臨床改善的RA患者血清水平下降的蛋白質(zhì)峰

Table2Down-regulated serum protein peaks in RA patients during inflimimab treatment

用藥時間m∕z8209 4m∕z3303 6m∕z9014 3m∕z8688 2m∕z5851 0m∕z6917 6m∕z4340 5m∕z4514 9m∕z5056 1m∕z10741 3治療前(第0周)37 25±25 5318 67±7 8159 51±14 6528 87±14 4514 36±7 6824 29±13 9421 24±5 9720 84±4 967 49±9 383 46±4 08治療中(第14周)9 81±4 493 99±3 0624 39±13 979 38±7 072 63±2 515 89±4 5211 04±5 1611 76±6 790 57±0 320 20±0 25治療后(第26周)8 87±5 966 63±5 4222 53±15 529 88±4 034 32±3 317 75±6 9410 59±3 8910 66±4 510 83±0 740 36±0 28P值0 00130 00170 00220 00230 00320 00390 00420 00620 00750 0092

RA：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎

表3英夫利西單抗治療后RA患者血清水平升高的蛋白質(zhì)峰

用藥時間m∕z5382 4m∕z5960 2治療前(第0周)2 65±3 083 54±5 18治療中(第14周)15 21±12 2138 23±30 79治療后(第26周)14 22±6 8324 78±15 93P值0 00140 0017

RA：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；mz：質(zhì)荷比

討　　論

TNF抑制劑是新型治療RA的生物制劑，目前已用于治療傳統(tǒng)藥物療效不佳的患者。判斷生物制劑療效的血清學(xué)生物標(biāo)志物除ESR及CRP外，還有致炎性細(xì)胞因子水平等。然而，由于此類生物制劑的價格昂貴，在國內(nèi)較難廣泛應(yīng)用，從藥效經(jīng)濟(jì)學(xué)角度看，如能發(fā)現(xiàn)預(yù)測生物治療療效的生物標(biāo)志物或?qū)O大程度地減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，更有效地選擇藥物，改善病情和改善預(yù)后。因此，尋找能夠反映生物制劑療效的新的生物標(biāo)志物的研究一直在進(jìn)行。

研究自身免疫病發(fā)病、病情和療效相關(guān)的生物標(biāo)志物的方法學(xué)有許多種，其中蛋白指紋圖譜的表達(dá)研究是了解自身免疫病的重要突破口。近年來，蛋白組學(xué)的研究快速發(fā)展，涌現(xiàn)了大量蛋白組學(xué)的研究方法并應(yīng)用于多種臨床疾病，風(fēng)濕免疫病中也有許多相關(guān)研究，如關(guān)于系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征、原發(fā)性膽汁性肝硬化等自身免疫病已發(fā)現(xiàn)了許多與發(fā)病機(jī)制相關(guān)的生物標(biāo)志物[11-13]。

圖1英夫利西單抗治療后RA患者血清水平下降的蛋白質(zhì)指紋圖譜

Fig1Expression of down-regulated serum protein in RA patients during Inflimimab treatment by MALDI-TOFMS analysis

RA：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎

圖2英夫利西單抗治療后RA患者血清水平升高的蛋白質(zhì)指紋圖譜

Fig2Expression of up-regulated serum proteins in RA patients during Inflimimab treatment by MALDI-TOFMS analysis

RA：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎

盡管TNF抑制劑治療RA已被廣泛接受，但利用蛋白組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)與TNF抑制劑治療RA相關(guān)的生物標(biāo)志物的研究并不多。Takeuchi等[8]通過2D膠蛋白組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，使用英夫利西治療后，患者血清中下降的蛋白分子包括CRP、血清淀粉樣蛋白A、血清淀粉樣蛋白P及α-酸糖蛋白，治療后升高的有視黃素結(jié)合蛋白、維生素D結(jié)合蛋白以及凝溶膠蛋白。Sekigawa等[9]利用二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(2D LC-MS/MS)檢測了TNF抑制劑治療后RA患者血清或血漿中與核轉(zhuǎn)錄因子(NF-kB)及關(guān)節(jié)軟骨代謝相關(guān)的蛋白水平發(fā)生改變。目前尚未發(fā)現(xiàn)利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)技術(shù)進(jìn)行相關(guān)研究的文章。

本研究利用MALDI-TOF-MS技術(shù)分析經(jīng)過英夫利西單抗治療前后RA患者血清蛋白指紋，旨在發(fā)現(xiàn)與療效相關(guān)的血清中小分子多肽。本研究發(fā)現(xiàn)，治療有效組患者m/z為8209.4、3303.6、9014.3、8688.2、5851.0、6917.6、4340.5、4514.9、5056.1和10 741.3的蛋白峰在治療后隨病情好轉(zhuǎn)而呈進(jìn)行性下降，且與DAS28、ESR和CRP水平呈正相關(guān)；治療無效的患者上述小分子蛋白則無上述變化。m/z為5382.5和5960.2的蛋白峰，無論針對治療有效患者還是無效患者均在治療后呈進(jìn)行性上升。根據(jù)上述結(jié)果筆者推測，治療后血清水平呈下降及上升的這兩類蛋白質(zhì)分子可能參與了RA的病情進(jìn)展，治療前高表達(dá)的蛋白促進(jìn)炎性反應(yīng)，在治療后下降；而治療前低表達(dá)的蛋白可能為抑制炎性的因子，治療后上升。另外，可以根據(jù)此結(jié)果判斷患者對TNF抑制劑的治療是否有反應(yīng)，如治療前上述隨治療而下降的蛋白為低表達(dá)，則表明該患者可能而對治療反應(yīng)不佳。

[1]Wiens A, Correr CJ, Pontarolo R, et al. A systematic review and meta-analysis of the efficacy and safety of etanercept for treating rheumatoid arthritis[J]. Scand J Immunol, 2009, 70：337-344.

[2]張文, 史群, 吳東海, 等. 英夫利昔單抗多中心臨床觀察[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志, 2009, 89：1876-1880.

[3]Goekoop-Ruiterman YP, de Vries-Bouwstra JK, Allaart CF, et al. Clinical and radiographic outcomes of four different treatment strategies in patients with early rheumatoid arthritis (the BeSt study)： a randomized, controlled trial[J]. Arthritis Rheum, 2008, 58：126-135.

[4]Wiens A, Correr CJ, Venson R, et al. A meta-analysis of the efficacy and safety of using infliximab for the treatment of rheumatoid arthritis[J]. Clin Rheumatol, 2009, 28：1365-1373.

[5]黃烽, 張奉春, 鮑春德, 等. 阿達(dá)木單抗聯(lián)合甲氨蝶呤治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的多中心、隨機(jī)、雙盲、安慰劑對照臨床研究[J]. 中華內(nèi)科雜志, 2009, 48：916-921.

[6]Prajapati R, Plant D, Barton A. Genetic and genomic predictors of anti-TNF response[J]. Pharmacogenomics, 2011, 12：1571-1585.

[7]王梅，劉素苗，張莉蕓.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎蛋白組學(xué)研究進(jìn)展[J].中華臨床免疫和變態(tài)反應(yīng)雜志，2012，6：308-312.

[8]Takeuchi T, Kotani T, Nakanishi T, et al. Proteomic analysis of changes in the serum protein profile by anti-TNF-alpha therapy[J]. Rinsho Byori, 2010, 58：332-336.

[9]Sekigawa I, Yanagida M, Iwabuchi K, et al. Protein biomarker analysis by mass spectrometry in patients with rheumatoid arthritis receiving anti-tumor necrosis factor-alpha antibody therapy[J]. Clin Exp Rheumatol, 2008, 26：261-267.

[10] Aletaha D, Neogi T, Silman AJ, et al. 2010 Rheumatoid arthritis classification criteria： an American College of RheumatologyEuropean League Against Rheumatism collaborative initiative[J]. Ann Rheum Dis, 2010, 69：1580-1588.

[11] 胡朝軍, 李永哲. 蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)在疾病研究中的應(yīng)用[J]. 臨床檢驗雜志, 2008, 26：227-229.

[12] 黃卓春, 石運瑩, 蔡蓓, 等. 運用蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)建立系統(tǒng)性紅斑狼瘡診斷模式的研究[J]. 四川大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版), 2009, 40：499-503.

[13] 胡朝軍, 李永哲, 趙冠飛, 等. 應(yīng)用蛋白指紋圖譜技術(shù)篩選原發(fā)性膽汁性肝硬化患者血清特異性標(biāo)志物[J]. 世界華人消化雜志, 2008, 16：277-283.