維吾爾族、漢族正常人群SCAl2亞型基因三核苷酸重復(fù)次數(shù)分析☆

李海濤馬建華雷晶張小寧

維吾爾族、漢族正常人群SCAl2亞型基因三核苷酸重復(fù)次數(shù)分析☆

李海濤*馬建華*雷晶*張小寧*

目的對新疆地區(qū)維吾爾族、漢族正常人群脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)12型(SCA12)PPP2R2B基因進(jìn)行研究。方法應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)、瓊脂糖凝膠電泳、直接測序等技術(shù)對維吾爾族、漢族健康者各90例進(jìn)行PPP2R2B基因CAG三核苷酸重復(fù)次數(shù)進(jìn)行分析。結(jié)果90例維吾爾族健康者PPP2R2B基因的CAG頻率的分布：共有13種PPP2R2B等位基因，CAG重復(fù)次數(shù)范圍為6～19次，平均重復(fù)次數(shù)為（10.84±3.18）次，10次重復(fù)最常見，90例漢族健康者PPP2R2B的CAG頻率的分布：共有12種PPP2R2B等位基因，CAG重復(fù)次數(shù)范圍為6～18次，平均重復(fù)次數(shù)為（11.32±2.26）次，10次重復(fù)也是最常見，沒有發(fā)現(xiàn)明顯異常的等位基因。通過進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)方法檢驗(yàn)，P>0.05,維吾爾族與漢族正常人群在PPP2R2B基因上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論新疆地區(qū)維吾爾族、漢族正常人群SCA12亞型PPP2R2B基因在CAG三核苷酸重復(fù)次數(shù)范圍、基因特點(diǎn)上無明顯差別。

脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào) 12型（SCAl2） PPP2R2B基因 三核苷酸重復(fù)

脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)（spinocerebellar ataxias, SCAs）是一大類以累及人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)為主的進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)變性病，是一種單基因遺傳病，多為常染色體顯性遺傳（autosomal dominant cerebellar ataxia,ADCA）[1]，約占神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病的10%～15%[2]，是神經(jīng)系統(tǒng)的多發(fā)病和常見病，然而SCA12型在SCAs中僅占1.2%，非常罕見。SCAs共同的病理改變主要是小腦、腦干和脊髓變性和萎縮，表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的對稱性共濟(jì)失調(diào)癥狀，通常起病后10～20年不能行走，而SCA12患者主要以小腦、大腦皮層損害為主，發(fā)病起始癥狀主要以走路不穩(wěn)、雙上肢震顫為特點(diǎn)。SCAs是一組包括多種共濟(jì)失調(diào)亞型的具有高度臨床和遺傳異質(zhì)性的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，大多數(shù)SCA亞型的發(fā)病與致病基因編碼區(qū)的CAG三核苷酸異常重復(fù)突變有關(guān)，而SCAl2型是一種惟一由致病基因PPP2R2B非編碼區(qū)CAG三核苷酸重復(fù)導(dǎo)致的SCA亞型。目前針對SCA12亞型研究相對較少,其正常PPP2R2B基因特點(diǎn)是否與地域、種群等因素有關(guān)是本次研究的關(guān)注點(diǎn)，所以我們對新疆地區(qū)維吾爾族、漢族正常人群各90例進(jìn)行了PPP2R2B基因CAG異常重復(fù)次數(shù)進(jìn)行檢測，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象新疆地區(qū)于我院門診體檢的維吾爾族、漢族正常人各90人。男各為47人，女各為43人，年齡15～56歲，平均年齡（36.52±1.32）歲。入選者均簽署了知情同意書。入選者需符合以下標(biāo)準(zhǔn)[3]：①無血緣關(guān)系；②否認(rèn)神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病家族史，例如：脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)、小腦腫瘤、多發(fā)性硬化、炎癥、腦血管病等疾病。正常SCA12亞型基因診斷標(biāo)準(zhǔn)：①國外Srivastava[4]報(bào)道：SCA12基因內(nèi)的CAG重復(fù)數(shù)正常范圍為4～32次；②國內(nèi)唐北沙[5]報(bào)道：SCA12基因內(nèi)的CAG重復(fù)數(shù)正常范圍5～27次。我們以國內(nèi)為主要標(biāo)準(zhǔn)，且需通過本次試驗(yàn)的基因測序進(jìn)一步驗(yàn)證或補(bǔ)充。

1.2 方法[6]

1.2.1 全血基因組DNA提取抽取外周靜脈血4mL。使用溶液型提取試劑盒，后進(jìn)行DNA定量。

1.2.2 目的基因CAG重復(fù)片段的PCR擴(kuò)增

1.2.2.1 （CAG）重復(fù)片段檢測根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)合成PCR引物﹙上海生工﹚：SCA12 F：5’－TGC TGG GAA AGA GTC GTG一3’，SCA12 R：5’－GCC AGC GCA CTC ACC CTC一3’。PCR反應(yīng)體系：DNA 200 ng，引物10 pmol，dNTP終濃度為200 μmol∕L，TaqDNA聚合酶1 U，GC-Bufferring溶液10μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃30 s，65℃40 s，72℃45 s（20個(gè)循環(huán)）；再95℃30 s,57.5℃40s，72℃45 s（14個(gè)循環(huán)）；最后72℃延伸7 min。

1.2.2.2 PCR產(chǎn)物檢測2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物（見圖1）；和我們前期研究的SCA12型陽性患者PCR產(chǎn)物電泳圖進(jìn)行對比[6]，可以看出：單一條帶為正常基因。雙條帶為突變基因。見圖2,入選者的CAG重復(fù)次數(shù)計(jì)算均采用PCR產(chǎn)物純化后直接測序。

圖1 PPP2R2B基因電泳圖

圖2 正常與異常PPP2R2B基因電泳圖（EA為異常基因，NA為正?；颍?/p>

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行處理。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。對維吾爾族、漢族健康者進(jìn)行PPP2R2B基因CAG三核苷酸重復(fù)次數(shù)進(jìn)行兩樣本t檢驗(yàn)，檢測水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 基因檢測正常維吾爾族健康者CAG重復(fù)次數(shù)為6～19次，平均（10.84±3.18）次，10次為最常見的頻率，約為41.11%（表1）。以上正常等位基因的連續(xù)CAG重復(fù)中間均未見其他堿基的插入。正常漢族健康者CAG重復(fù)次數(shù)為6～18次，平均（11.32±2.26）次，10次為最常見的頻率，約為38.23%（表2）。以上正常等位基因的連續(xù)CAG重復(fù)中間均未見其他堿基的插入。見圖3-5。

3 討論

SCAl2亞型目前國外報(bào)道[7]僅見于德裔美國人及印度血統(tǒng)人，在印度已發(fā)現(xiàn)35個(gè)SCAl2家系，成為印度除SCA2以外最普遍的SCA亞型。Duenas[8]曾在英國和法國做過大量的SCAl2突變檢測沒有發(fā)現(xiàn)患者。目前國內(nèi)尚有個(gè)別SCAl2家系的報(bào)道，遺憾的是未能進(jìn)一步精確得到患者PPP2R2B基因的測序圖。Holmes等[9]報(bào)道了CAG正常重復(fù)7～30次,患者CAG重復(fù)66～78次。Cholfin等[10]報(bào)道CAG正常重復(fù)次數(shù)為4～32次，不外顯或不完全外顯的中間類型等位基因CAG重復(fù)次數(shù)33～50次為過渡范圍，完全外顯的異常等位基因即患者的CAG重復(fù)次數(shù)51～78次。謝秋幼等[11[5]報(bào)道1名患者51次，2名患者52次，正常重復(fù)數(shù)在5～21次。

表1 90例維吾爾族健康者SCA12基因中CAG重復(fù)序列拷貝術(shù)的分布

國外報(bào)道[12]的正常SCAl2亞型PPP2R2B基因的CAG重復(fù)分布圖有2個(gè)波峰，第1個(gè)在10次和對應(yīng)的CAG重復(fù)處，第2個(gè)圍繞在13～15次CAG重復(fù)處，而我們的研究和國外報(bào)道的略有不同，入選者中CAG重復(fù)頻率分布比較分散，在10、13和9次3處各有1個(gè)明顯的波峰，且3處所占總體的比例與國外報(bào)道的有明顯差別，這可能為新疆維吾爾族正常SCA12亞型基因中CAG三核苷酸重復(fù)頻率分布的一個(gè)特征。

圖3 SCA12維吾爾族PPP2R2B正常等位基因測序圖（CAG重復(fù)10次為最常見的頻率）

圖4 SCA12漢族PPP2R2B正常等位基因測序圖（CAG重復(fù)16次）

圖5 SCA12維吾爾族PPP2R2B正常等位基因測序圖（CAG重復(fù)19次）

表2 90例漢族健康者SCA12基因中CAG重復(fù)序列拷貝術(shù)的分布

國內(nèi)王俊玲等[3]報(bào)道湖南漢族健康者PPP2R2B的CAG頻率的分布：在252名健康對照者中共有13種PPP2R2B等位基因，PPP2R2B基因的CAG重復(fù)次數(shù)范圍為5～21次，平均重復(fù)次數(shù)為13次，10次重復(fù)最常見，沒有發(fā)現(xiàn)明顯異常的等位基因。沒有CAG重復(fù)連續(xù)不被打斷。我們報(bào)道的維吾爾族、漢族中PPP2R2B基因的CAG重復(fù)次數(shù)范圍為6～19次，最常見的重復(fù)次數(shù)均為l0次，且在連續(xù)CAG重復(fù)間沒有發(fā)現(xiàn)明顯異常的等位基因。沒有CAG重復(fù)連續(xù)被打斷。這與國內(nèi)外報(bào)道的正常PPP2R2B基因的CAG重復(fù)次數(shù)范圍、基因特點(diǎn)是一致的。我們研究團(tuán)隊(duì)在國內(nèi)首次針對維吾爾族SCA12型PPP2R2B基因正常CAG重復(fù)次數(shù)范圍進(jìn)行分析，這對進(jìn)行維吾爾族及漢族的SCA12亞型的臨床診斷及鑒別診斷起著良好的提示作用。新疆地區(qū)維吾爾族及漢族在SCA12基因中的一致性，在國內(nèi)也是首次進(jìn)行報(bào)道，是否能得出正常PPP2R2B基因與種群、地域等無關(guān)，我們還需擴(kuò)大樣本量繼續(xù)進(jìn)行研究。

[1]O'HearnE,Holmes SE,Margolis RL.Spinocerebellar ataxia type 12[J].Handb Clin Neurol,2012,103:535-547.

[2]Holmes SE,Hearn EO,Ross CA,et al.SCA12:an unusual muta? tion leadsto an unusual spinocerebellar ataxia[J].Brain Res Bull,2001,56(3-4):397-403.

[3]王俊玲,江弘,張申,等.湖南漢族人群PPP2R2B基因三核苷酸重復(fù)突變[J].中華神經(jīng)科雜志,2008,26（7）:455-456.

[4]Srivastava,Choudhry.Molecular and clinical correlation in five Indian families with spinocerebellar ataxia 12[J].Ann Neurol, 2001,50（6）:796-800.

[5]王俊玲,徐倩,雷立芳,等.脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)患者CAG病理重復(fù)次數(shù)檢測[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志,2009,26（6）:620-625.

[6]李海濤,雷晶,馬建華,等.脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)12型一維吾爾族家系的基因突變及臨床特點(diǎn)[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志, 2011,28（2）:137-141.

[7]Bahl S,Virdi K,Mittal U,et al.Evidence of a common founder for SCA12 in the Indian population[J].Ann Hum Genet,2005,69 (5):528-534.

[8]Duenas AM,Goold R,Giunti P,et al.Molecular pathogenesis of spinocerebellar ataxias[J].Brain,2006,129（6）:1357–1370.

[9]Holmes SE,O'Hearn E,Marqolis RL.Why is SCA12 different from other SCAs[J].Cytogenet-Genome-Res,2003,100（1-4）: 189-197.

[10]Cholfin JA,Sobrido MJ,Perlman S,et al.The SCA12 mutation as a rare cause of spinocerebellar ataxia[J].Arch Neurol,2001,58 (11):1833-1835.

[11]謝秋幼,梁秀齡,李洵樺,等.脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)12型的分子遺傳學(xué)診斷及臨床分析[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)科學(xué)版), 2004,25(2):138-140.

[12]Fujigasaki H,Verma IC,Camuzat A,et al.SCA12 is a rare locus for autosomal dominant cerebellar ataxia:a study of an Indian family[J].Ann-Neurol,2001,49(1):117-121.

R741.04

A

2012-07-12）

（責(zé)任編輯:李立）

10.3936/j.issn.1002-0152.2013.03.008

☆新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金（編號：201211A063）

*新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（烏魯木齊市830054）

（Email：zxn-1960@163.com）