GC法測(cè)定活血止痛散（片）中冰片、樟腦的含量

王云霞 張 楠 謝志民 西安市食品藥品檢驗(yàn)所（西安710054）

活血止痛散（片）是2012年國家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)項(xiàng)目，由當(dāng)歸、三七、制乳香、冰片、?蟲、煅自然銅六味中藥組成，具有活血散瘀、消腫止痛的功效，主要用于跌打損傷，瘀血腫痛等癥。冰片為方中清熱止痛的主要組成，冰片在合成過程中會(huì)產(chǎn)生或殘留一定量的樟腦，近年來更有人為摻雜樟腦的現(xiàn)象，內(nèi)服會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生一定的毒副作用，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)僅有冰片的薄層鑒別項(xiàng)目，無含量控制和樟腦限度控制要求［1，2］。參照中國藥典［1，3］，本文建立了用 GC法測(cè)定成品中龍腦、異龍腦及樟腦的含量測(cè)定方法，作為成品中冰片質(zhì)量的控制方法。

1 儀器與試藥 1.1 儀 器 安捷倫7890A型氣相色譜儀，7890A／GC色譜工作站；Agilent Technologies毛細(xì)管柱：DB－WAX 型（長30m，內(nèi)徑0.32mm，涂 層厚度 0.25μm），HP－INNOWAX 型 （長30m，內(nèi)徑0.32mm，涂層厚度0.25μm）；Thermo Scientific TG－WAXMS毛細(xì)管柱（長 30m，內(nèi)徑 0.32mm，涂層厚度0.25μm）；昆山市超聲儀器有限公司KQ－300DE型數(shù)控超聲波清洗器。

1.2 試劑與試藥 乙酸乙酯為分析純（廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心）。龍腦對(duì)照品（110881－201107，含 量 99.3%）、異龍腦對(duì)照品（111512－200201）、樟腦對(duì)照品（110747－201008），均為中國食品藥品生物制品檢定院提供（供含量測(cè)定用）。

2 方法與結(jié)果 2.1 色譜條件 采用聚乙二醇20000（PEG－20M）毛細(xì)管柱（柱長30m，內(nèi)徑為0.32mm，膜厚度為0.25μm），柱溫為程序升溫，初始溫度為130℃，保持3min，以2℃／min的速率升至140℃，保持5min；分流進(jìn)樣，分流比1∶10；載氣流速1mL／min。理論塔板數(shù)按龍腦峰計(jì)算應(yīng)不低于10000。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取龍腦對(duì)照品、異龍腦對(duì)照品、樟腦對(duì)照品適量，加乙酸乙酯制成每1mL含龍腦0.25mg、異龍腦0.20mg、樟腦3μg的混合溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備 取本品粉末，置具塞錐形瓶中，精密加入乙酸乙酯20mL，稱定重量，超聲處理（功率150W，頻率45kHz）20min，放涼，再稱定重量，用乙酸乙酯補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 精密稱取樟腦對(duì)照品（批號(hào)110721－200507）12.26mg，置10mL量瓶中，加乙酸乙酯使溶解，并加至刻度，搖勻，作為6號(hào)對(duì)照品溶液；再精密稱取龍腦對(duì)照品（批號(hào)110881－201107，含量99.3%）15.40mg、異龍腦對(duì)照品（批號(hào)111512－200201）12.00mg，置同一10mL量瓶中，精密加入6號(hào)對(duì)照品溶液2mL，加乙酸乙酯使溶解，并加至刻度，搖勻，作為5號(hào)對(duì)照品溶液；精密吸取5號(hào)對(duì)照品溶液5mL，置25mL量瓶中，加乙酸乙酯至刻度，搖勻，作為4號(hào)對(duì)照品溶液；精密吸取4號(hào)對(duì)照品溶液5mL，置25mL量瓶中，加乙酸乙酯至刻度，搖勻，作為3號(hào)對(duì)照品溶液；精密吸取3號(hào)對(duì)照品溶液5mL，置10mL量瓶中，加乙酸乙酯至刻度，搖勻，作為2號(hào)對(duì)照品溶液；精密吸取2號(hào)對(duì)照品溶液5mL，置10mL量瓶中，加乙酸乙酯至刻度，搖勻，作為1號(hào)對(duì)照品溶液。精密吸取1～6號(hào)對(duì)照品溶液各1μL進(jìn)樣2次，按上述色譜條件測(cè)定峰面積。以峰面積平均值為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量（ng）為橫坐標(biāo)，計(jì)算得龍腦回歸方程Y＝0.64318X－0.4208、r＝0.999999，異龍腦回歸方程Y＝0.64223X－0.1336、r＝0.999999，樟腦回歸方程 Y＝0.6168X＋0.6358、r＝0.99996，表明在該系統(tǒng)條件下，龍腦進(jìn)樣量在15.2922ng～1529.22ng范圍內(nèi)、異龍腦進(jìn)樣量在12.0ng～1200.0ng范圍內(nèi)，樟腦進(jìn)樣量在2.452ng～1226ng范圍內(nèi)，峰面積積分值與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取上述1、3、5號(hào)對(duì)照品溶液1μL，各進(jìn)樣5次，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算變異系數(shù)。結(jié)果RSD均小于1.7%。表明本方法龍腦進(jìn)樣量在15.2922ng～1529.22ng范圍內(nèi)、異龍腦進(jìn)樣量在12.0ng～1200.0ng范圍內(nèi)、樟腦進(jìn)樣量在2.452ng～1226ng范圍內(nèi)進(jìn)樣精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批活血止痛散粉末0.5g，活血止痛片粉末0.55g，置具塞錐形瓶中，分別精密加入乙酸乙酯各20mL，稱定重量，分別超聲處理（功率150W，頻率40kHz）20min，取出，放涼，再稱定重量，用乙酸乙酯補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，棄去初濾液。精密吸取續(xù)濾液和標(biāo)準(zhǔn)曲線考察項(xiàng)下的2號(hào)對(duì)照品溶液各1μL，注入氣相色譜儀，按標(biāo)準(zhǔn)曲線考察項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定龍腦、異龍腦、樟腦色譜峰面積，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，結(jié)果表明散劑、片劑樣品測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性均良好，RSD均小于1.1%。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別于0h、2h、4h、8h、12h、16h、20h和24h精密吸取同一供試品溶液1μL進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定龍腦、異龍腦、樟腦峰面積，計(jì)算變異系數(shù)。結(jié)果表明本品散劑、片劑中龍腦、異龍腦、樟腦均在24h內(nèi)穩(wěn)定，峰面積RSD均小于1.6%。

2.8 加樣回收試驗(yàn) 活血止痛散：精密吸取標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下6號(hào)對(duì)照品溶液2mL，置25mL量瓶中，加乙酸乙酯至刻度，搖勻，作為樟腦對(duì)照品溶液。精密稱取龍腦對(duì)照品（批號(hào)110881－201107，含量99.3%）9.66mg、異龍腦對(duì)照品（批號(hào)111512－200201）9.04mg，置10mL量瓶中，精密加入樟腦對(duì)照品溶液2mL，加乙酸乙酯溶解至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。精密稱取重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下所用活血止痛散0.25g、0.375g各3份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入對(duì)照品溶液2mL和1mL，再分別精密加入乙酸乙酯20mL，稱定重量，超聲處理（功率150W，頻率40kHz）20min，取出，放涼，再稱定重量，用乙酸乙酯補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，棄去初濾液。精密吸取續(xù)濾液和線性考察項(xiàng)下2號(hào)對(duì)照品溶液各1μL，注入GC儀，測(cè)定，計(jì)算。

活血止痛片：精密吸取標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下6號(hào)對(duì)照品溶液2mL，置25mL量瓶中，加乙酸乙酯至刻度，搖勻，作為樟腦對(duì)照品溶液。精密稱取龍腦對(duì)照品（批號(hào)110881－201107，含量99.3%）13.45mg、異龍腦對(duì)照品（批號(hào)111512－200201）7.90mg，置25mL量瓶中，精密加入樟腦對(duì)照品溶液2mL，加乙酸乙酯溶解至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。精密稱取重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下所用活血止痛片樣品粉末0.27g、0.40g各3份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入對(duì)照品溶液2mL和1mL，再分別精密加入乙酸乙酯20mL，照上述方法測(cè)定。

結(jié)果顯示，活血止痛散和活血止痛片兩個(gè)添加量，龍腦的平均加樣回收率分別為99.84%和98.84%，RSD分別為0.91%和0.84%（n＝6）；異龍腦的平均加樣回收率分別為99.07%和99.11%，RSD分別為0.76%和2.38%（n＝6）；樟腦的平均加樣回收率分別為102.54%和99.72%，RSD分別為2.27%和2.20%（n＝6）。

2.9 樣品含量測(cè)定 我們測(cè)定了4個(gè)生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的33批活血止痛散樣品，4個(gè)生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的54批次活血止痛片樣品，結(jié)果活血止痛散每1g含冰片6.05～22.09mg、平均16.51mg，含龍腦為3.39～12.94mg、平均9.73mg，含樟腦29.4～494.3μg、平均122.33μg；活血止痛片每片（換算為含活血止痛散0.37g）含冰片0.13～6.36mg、平均2.94mg，含龍腦為0.09～3.65mg，平均1.80mg，含樟腦5.8～34.9μg，平均9.74μg。

3 討 論 研究過程中采用正交實(shí)驗(yàn)的方法對(duì)不同超聲功率和時(shí)間的提取效果進(jìn)行了考察，結(jié)果表明超聲功率和超聲時(shí)間均對(duì)龍腦和異龍腦的測(cè)定結(jié)果無顯著性影響，為了保證提取液雜質(zhì)少、提取完全、測(cè)定周期短，確定了上述供試液的制備方法，超聲處理過程中應(yīng)注意水溫控制在25℃以下。

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)證明本系統(tǒng)在不同品牌的色譜柱、不同進(jìn)樣口溫度（160℃～240℃）、不同檢測(cè)溫度（230℃～270℃）、不同載氣流速（0.8mL／min～1.2mL／min）、不同分流比（1／4～1／12）、不同程序升溫（初始溫度為120℃～140℃，保持3min，以2℃／min的速率升至130℃～150℃）條件下龍腦、異龍腦和樟腦均分離良好、峰形對(duì)稱，可用于含量測(cè)定。陰性對(duì)照樣品在龍腦、異龍腦和樟腦峰處均無色譜峰出現(xiàn)，不干擾本品的測(cè)定。

活血止痛膠囊與活血止痛散處方一致，本法亦適用于活血止痛膠囊中冰片的質(zhì)量控制。

［1］國家藥典委員會(huì).中國藥典［S］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：956，422，620.

［2］國家食品藥品監(jiān)督管理局.國家藥品標(biāo)準(zhǔn)［S］.北京：YBZ30222005－2009Z.

［3］國家藥典委員會(huì).中國藥典［S］.第二部.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：1108.