低氧對間充質(zhì)干細胞的影響及其調(diào)控機制研究進展

何睿智，李俞婷，朱敏潔

(1華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院第二臨床學(xué)院，武漢430030;2華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院;3華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

間充質(zhì)干細胞(MSC)是一種具有自我更新分化能力與廣泛組織分布的成體干細胞，可從自身的脂肪、骨髓、外周血中獲取，并可向脂肪、骨、軟骨以及血管內(nèi)皮方向分化，且相對于胚胎干細胞引起較輕的自身免疫反應(yīng)［1］，因而，MSC移植成為許多退行性疾病和自身免疫性疾病很有前景的治療方法。MSC受自身和外在多種因素的調(diào)控，其中電生理的條件，包括氧分壓對MSC的功能有重要作用。有研究證明，MSC的體內(nèi)正常生存環(huán)境的氧分壓低至1% ～2%，更接近MSC的生理環(huán)境［2］。在此，我們對低氧分壓對MSC的影響及其信號機制作一綜述。

1 低氧對MSC存活的影響

MSC植入組織后，存活率極低，然而目前很多研究表明，低氧條件預(yù)處理可降低MSC凋亡率，提高存活率［3，4］。

1.1 低氧的直接作用 MSC在21%O2中處于一個相對氧濃度過高的狀態(tài)，可生成活性氧，激活凋亡基因Bax、Bak，最終使線粒體膜通透性增加而導(dǎo)致細胞凋亡，而低氧則有效地抑制了這一過程，從而阻止凋亡。然而，有人觀察到低氧條件下的MSC隨著時間的延長，細胞凋亡率上升，但Zhu等［5］認為，低氧并不是導(dǎo)致細胞凋亡的直接原因，營養(yǎng)的缺乏才是其關(guān)鍵因素。雖然同期也有實驗表明低氧降低了MSC的生存率，這可能與用于研究的細胞的年齡和低氧的程度有關(guān)。

1.2 低氧激活A(yù)kt信號通路 與常氧濃度相比，低氧條件下培養(yǎng)16 h后細胞的凋亡率下降，同時pAkt(磷酸化的Akt)增加，認為低氧條件培養(yǎng)的MSC能夠激活A(yù)kt信號通路［4］，pAkt可使 Bad的 Serl36位點磷酸化，有效阻斷Bad與Bcl-2或Bcl-xl形成復(fù)合體而表現(xiàn)促凋亡活性，Bcl-2能夠穩(wěn)定線粒體通透性的改變，從而阻止促凋亡因子如凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)、細胞色素C的釋放。pAkt還可抑制細胞中半胱天冬酶-3酶原(procaspase-3)向Caspase-3的轉(zhuǎn)化，下調(diào)Caspases的表達，從而抑制凋亡，同時調(diào)節(jié)細胞內(nèi)葡萄糖的代謝，增加低氧時能量的供應(yīng)。

1.3 低氧增強c-Met信號和促進VEGF表達 低氧預(yù)處理24 h后傳代培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，第2～6代的細胞VEGF、c-Met的表達量明顯增加［3］，表明低氧增強c-Met信號并促進VEGF表達。c-Met是肝細胞生長因子(HGF)的主要受體，當與HGF結(jié)合后，可引發(fā)系列磷酸化反應(yīng)調(diào)控細胞增殖，而c-Met信號也可調(diào)節(jié)細胞的黏附、侵襲能力和參與血管形成過程。HIF-1α存在于胞質(zhì)內(nèi)，是低氧誘導(dǎo)因子(HIF)的組成部分，常氧時迅速被降解，低氧能夠穩(wěn)定HIF-1α，讓其進入細胞核與HIF-1β結(jié)合，啟動VEGF、bFGF等低氧相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。VEGF促進干細胞向血管內(nèi)皮方向轉(zhuǎn)化，對梗死部位血流的重建有重要的意義;除此之外，VEGF還能夠通過與血管生成無關(guān)的機制降低細胞凋亡率，延緩衰老［6］。Rosová 等［4］人的研究發(fā)現(xiàn)，將MSC移植入小鼠后肢缺血模型，低氧組在前5天比正常組有很大改善，主要得益于低氧組血流恢復(fù)快。

1.4 其他 Pterson等［7］研究發(fā)現(xiàn)，低氧時survivin和pERK等抗凋亡分子表達都下調(diào)，然而細胞的存活率增加，同時內(nèi)源性超氧化物歧化酶(SOD)的表達增加，因此認為低氧能提高抗氧化酶活性，降低親氧化酶活性，減少活性氧的生成，使MSC處于更好的平衡狀態(tài)。

2 低氧對MSC增殖的影響

目前，多認為低氧促進MSC增殖。眾多實驗表明，不同來源的MSC在低氧時細胞增殖能力顯著提高，其主要受HIF-TWIST通路、ERK通路以及其他的機制調(diào)控。

2.1 HIF-TWIST通路調(diào)控增殖 HIF是由芳香烴受體核轉(zhuǎn)運分子(ARNT)和HIF-1α組成的異質(zhì)二聚體，HIF-1α可受O2濃度的調(diào)節(jié)而影響HIF的活性。TWIST是一基本的堿性螺旋—環(huán)—螺旋(bHLH)轉(zhuǎn)錄因子，通過上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型(EMT)可促進腫瘤轉(zhuǎn)移［8］，是HIF-1α下游的靶分子。低氧誘導(dǎo)HIF-1α表達增加，HIF-1α可調(diào)控TWIST，而使其增加。TWIST以劑量依賴的方式，通過結(jié)合E2A的啟動子E-box，負性調(diào)控另一bHLH轉(zhuǎn)錄因子E2A。E2A能通過激活p21基因的方式抑制細胞增殖。E2A下調(diào)解除抑制細胞增殖，使細胞更長時間地處于增殖狀態(tài)從而增加細胞的數(shù)量［9～12］。故能觀察到低氧時處于G0/G1期的細胞減少，而S期和G2/M期的細胞增多，同時促進衰老基因p21的表達下降［9］。

2.2 ERK抑制p16表達調(diào)控增殖 MSC在常氧培養(yǎng)時，p16表達不斷上調(diào)，而1%O2抑制了p16的表達，并可見衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(SA-beta-gal)陽性細胞明顯減少，而這一過程檢測整個MAPK通路相關(guān)分子只有ERK有明顯差異［13，14］。細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)，也被稱為絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)，最早發(fā)現(xiàn)可介導(dǎo)絲裂原的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。低氧有效抑制ERK1和ERK2的磷酸化，下調(diào)了p16基因的表達，抑制p16-Rb旁路ROS介導(dǎo)的細胞衰老，從而通過ERK信號調(diào)控增殖。通過檢測HIF-1α誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗氧化劑nPG，推斷該過程獨立于HIF 通路［11］。

2.3 其他 低氧時可檢測到細胞增殖標記物CENPF［13］、PCNA 表達增加，而且 Cyclin D1 表達上調(diào)，CDK抑制劑p27下調(diào)［14］，認為低氧時細胞數(shù)的增多與細胞周期的加快有關(guān)。Ma等人發(fā)現(xiàn)，2%O2增強MSC的增殖，同時可上調(diào)干性基因OCT-4的表達上調(diào)，因此認為OCT-4在增殖的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用［15～17］。

3 低氧對MSC分化的影響

3.1 成骨分化 多種來源的MSC已被證明可以分化為骨組織，多數(shù)的研究表明低氧抑制MSC的成骨分化［18～20］。低氧時MSC成骨分化能力比常氧時明顯減弱，檢測細胞里的ALP和OPN，其表達均略有下降，并且成骨相關(guān)基因RUNX、Ⅰ型膠原纖維、骨鈣蛋白的表達都下調(diào)［17］。雖然有研究結(jié)論完全相反［16，21］，但他們的研究結(jié)果均一致發(fā)現(xiàn)，HIF-1α 表達上調(diào)，并認為RUNX低氧時的調(diào)節(jié)與HIF-1α的表達有關(guān)。RUNX2(即Cbfα1)，是成骨過程中的一個重要調(diào)節(jié)基因，它的表達及對下游基因的控制在成骨分化及成熟中發(fā)揮重要作用［20］。RUNX2有T1和T2兩種異構(gòu)體，TI RUNX主要表達于成骨細胞和軟骨細胞的前體細胞中，可被FGF2誘導(dǎo)上調(diào)，并促進BMP2的表達，同時這又可提高T2 RUNX的轉(zhuǎn)錄。TWIST可以直接與RUNX P2的啟動子(調(diào)節(jié)T1 RUNX的表達)結(jié)合，從而阻止T1 RUNX的表達，因而抑制 BMP2，從而降低 T2 RUNX和 T2 RUNX 下游的靶分子的表達［16］。Huang 等［19］人的實驗也表明，HIF-1α下調(diào)RUNX的表達，但在培養(yǎng)過程中逐漸下調(diào)的RUNX，其表達隨之上調(diào)，但是低氧誘導(dǎo)RUNX上調(diào)的機制卻不清楚。

3.2 軟骨分化 低氧對軟骨形成的影響的研究比較多，只有少數(shù)的研究發(fā)現(xiàn)低氧抑制軟骨形成，其他的實驗都表明低氧促進軟骨形成［14，19～24］。實驗中，低氧不僅使軟骨分化標志物Ⅱ型膠原蛋白(COL2A1)的表達提前，還提高了COL2A1表達的總量［14，20］，同時 SOX9 的表達也增加［17］。Zscharnack等［12］的研究表明，低氧使 X型膠原蛋白(COL10)表達增加。然而，F(xiàn)elka 等［22］發(fā)現(xiàn)，2%O2下調(diào)COL10的表達。已有研究表明低氧對軟骨形成的影響可以通過 p38MAPK和 pAkt介導(dǎo)［23］，p38MAPK和pAkt低氧時可以穩(wěn)定HIF-1α，阻止HIF-1α的降解，增強HIF-1α的作用，HIF-1α可以上調(diào)SOX9和COL2A1的表達，從而促進軟骨分化。Murphy等［21］發(fā)現(xiàn)，HIF-2α在低氧促進MSC軟骨方向分化過程中也很重要，不僅加速軟骨分化的啟動，還可以通過維持高水平的SOX9降低COL10的表達，阻止終末分化。

3.3 脂肪分化 低氧對MSC向脂肪方向分化的研究相對較少，而且實驗的方法各不相同，說法尚不統(tǒng)一。Huang 等［14］和 Weijers等［17］研究發(fā)現(xiàn)，1%O2抑制ASC的分化，成脂相關(guān)基因ADPN和脂蛋白脂肪酶 LPL表達減少。Martin-Rendon等［13］發(fā)現(xiàn)，在1.5%O2中短時間培養(yǎng)后，成脂分化與常氧時無明顯差異。Valorani等［24］采用先在增殖培養(yǎng)基，2%O2中培養(yǎng)AT-MSC 10 d后再用分化培養(yǎng)基培養(yǎng)3周的處理方法，發(fā)現(xiàn)低氧抑制成脂分化，然而當他們改用1%O2中增殖，再在常氧情況下分化發(fā)現(xiàn)低氧組的分化反而增強，這與Fehrer等［10］的研究結(jié)果相一致。表明低氧可能只是暫時地抑制了成脂分化。

雖然已有研究表明MSC還可以分化為血管內(nèi)皮細胞、神經(jīng)細胞，但是低氧對其分化的影響研究較少，在此不作介紹。

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