Nrf2-ARE通路調(diào)控減輕器官缺血再灌注損傷機(jī)制的研究進(jìn)展

李智濤，黃漢飛，曾 仲

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，昆明650032)

缺血再灌注損傷(IRI)是指缺血缺氧器官或組織細(xì)胞損傷在恢復(fù)血供氧供之后反而加重的現(xiàn)象。核轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(Nrf2)—抗氧化反應(yīng)元件(ARE)是目前為止發(fā)現(xiàn)的、最為重要的內(nèi)源性抗氧化體系，是機(jī)體重要的自我防御系統(tǒng)，激活Nrf2-ARE信號(hào)通路可增加細(xì)胞抗氧化蛋白表達(dá)，通過(guò)抗凋亡、抑制線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換(MPT)、減輕炎癥等機(jī)制減輕IRI?，F(xiàn)將Nrf2-ARE信號(hào)通路的調(diào)控方式及其減輕IRI的機(jī)制綜述如下。

1 Nrf2-ARE信號(hào)通路

1．1 Nrf2的基本結(jié)構(gòu) Nrf2屬于CNC亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄激活因子家族成員(CNC-bZIP)，含有一個(gè)基本亮氨酸結(jié)構(gòu)域。該家族成員還有P45、P53、Nrf1、Nrf3、Bach1、Bach2。Nrf2含 Neh1～Neh6共6個(gè)結(jié)構(gòu)域，Neh3是Nrf2發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性必不可少的部分，Neh4、Neh5可與共激活因子結(jié)合蛋白結(jié)合，協(xié)同參與Nrf2發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性［1］。Neh2結(jié)構(gòu)域內(nèi)的DLG、ETGE序列與Keap1二聚體中的DGR結(jié)構(gòu)域結(jié)合，形成“門(mén)閂—鉸鏈”結(jié)構(gòu)，發(fā)揮Keap1對(duì)Nrf2的活性調(diào)控作用［2］。Neh1區(qū)可以與 sMaf蛋白結(jié)合形成Nrf2-sMaf異源二聚體，結(jié)合ARE啟動(dòng)子，啟動(dòng)多種抗氧化蛋白的轉(zhuǎn)錄。研究認(rèn)為，Nrf2發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性需要與其他亮氨酸拉鏈蛋白形成異源二聚體［3］，如Jun、sMaf。

1．2 Nrf2的活性調(diào)控 Nrf2的活性調(diào)節(jié)主要依靠Keap1的負(fù)性調(diào)節(jié)及磷酸激酶對(duì)Nrf2的磷酸化調(diào)節(jié)，此外P21、PGAM5也參與Nrf2的活性調(diào)控。

生理情況下，Nrf2被Keap1錨定于胞質(zhì)的肌動(dòng)蛋白，Keap1-Nrf2復(fù)合物可作為Cul3/Rbx-E3適配底物被泛素化，進(jìn)而被26S蛋白酶降解，從而維持胞內(nèi)Nrf2低水平。Keap1結(jié)構(gòu)上是同源二聚體蛋白，每個(gè)單體均含BTB、DGR、CTR、IVR四個(gè)結(jié)構(gòu)域，兩個(gè)BTB連接Keap1二聚體單元，與Nrf2的Neh2區(qū)的DLG、ETGE形成“門(mén)閂—鉸鏈”結(jié)構(gòu)。Keap1的IVR結(jié)構(gòu)域有大量半胱氨酸殘基(Cys)，ROS、親電物質(zhì)、重金屬、NO可使Cys氧化或亞硝基化，Keap1構(gòu)象因此發(fā)生變化，此時(shí)DLG與DGR連接的“門(mén)閂”斷開(kāi)，Nrf2不能繼續(xù)被泛素化降解，繼而新合成Nrf2轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性。Keap1是目前發(fā)現(xiàn)的Nrf2最重要的負(fù)性調(diào)控因子，Keap1敲除小鼠因Nrf2過(guò)度激活，出生后僅能生存幾天［4］。這間接證明了Keap1的重要性，其他調(diào)控因子則沒(méi)有類(lèi)似作用。

此外，在Nrf2編碼區(qū)存在兩個(gè)類(lèi)ARE元件［5］，可能是Nrf2的正反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。Lo等［6］研究證實(shí)，線粒體甘油酸異構(gòu)酶PGAM5可結(jié)合Keap1-Nrf2復(fù)合體形成三元復(fù)合物，將Nrf2束縛在線粒體內(nèi)發(fā)揮Nrf2活性負(fù)性調(diào)節(jié)作用，敲除PGAM5和Keap1基因均可激活Nrf2轉(zhuǎn)錄活性。P21可以與Keap1競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合 Nrf2的 DLG序列，打開(kāi)“門(mén)閂”，穩(wěn)定Nrf2，激活 Nrf2 轉(zhuǎn)錄活性［7］。

1．3 Nrf2的磷酸化調(diào)節(jié) 蛋白激酶C(PKC)、有絲分裂原激活蛋白激酶(MAPKs)、磷脂酰肌醇激酶3(PI3K)均可直接磷酸化Nrf2而激活其轉(zhuǎn)錄活性，目前已明確Nrf2的Ser40可被PKC磷酸化激活［8］，Ser40磷酸化后可以導(dǎo)致Keap1與Nrf2親和力降低。實(shí)驗(yàn)證明，PKC、JUNK、ERK、MAPK 均參與了Nrf2 的激活［9，10］。

Nrf2的磷酸化還可介導(dǎo)Nrf2的負(fù)性調(diào)節(jié)，在Nrf2轉(zhuǎn)錄活性被激活的同時(shí)，GSK-3β絲氨酸殘基被PKC磷酸化，磷酸化的GSK-3β使Fyn磷酸化，磷酸化的Fyn進(jìn)入胞核，使Nrf2的酪氨酸殘基Tyr56磷酸化，磷酸化的Nrf2轉(zhuǎn)至胞質(zhì)，失去轉(zhuǎn)錄活性，再次被泛素化降解［11］。

2 Nrf2-ARE與IRI

2．1 增加血紅素氧合酶-1(HO-1)表達(dá) HO-1是一種應(yīng)激蛋白，是催化血紅素降解的起始酶和限速酶。HO-1是重要的自由基清除劑及抗IRI因子，具有抗氧化、抗炎和抑制血小板聚集作用。基因轉(zhuǎn)染和藥物激活均可通過(guò)過(guò)表達(dá)HO-1減輕肝IRI。對(duì)腦［12］、腎臟［13］、神經(jīng)［14］、腸［15］等組織 IRI的研究發(fā)現(xiàn)，激活Nrf2/ARE信號(hào)通路可以誘導(dǎo)HO-1過(guò)表達(dá)，產(chǎn)生保護(hù)性作用。

2．2 增加GSH合成 Nrf2啟動(dòng)下游基因可以增加多種GSH合成酶類(lèi)，如γ-谷胺酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)。γ-GCS是谷胱甘肽(GSH)從頭合成途徑中的限速酶，從頭合成途徑是GSH合成的主要途徑。此外Nrf2還可以增加谷氨酸半胱氨酸連接酶(GCL)、谷胱甘肽還原酶(GR)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶合成，維持GSH還原系統(tǒng)的穩(wěn)定性［16］。在通過(guò)激活 Nrf2 減輕腎 IRI［13］、腸缺血所致肝損傷［15］的研究中，證實(shí) γ-GCS、GR、Gpx、GCL具有保護(hù)作用。在細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷研究中發(fā)現(xiàn)，激活Nrf2可以增加GSH合成，抑制細(xì)胞凋亡。

2．3 增加過(guò)氧化物歧化酶(SOD)表達(dá) SOD是清除過(guò)氧化物的重要酶類(lèi)。外源性導(dǎo)入SOD或基因轉(zhuǎn)染造成SOD過(guò)表達(dá)均可減輕肝IRI損傷［17］。在Nrf2 減輕腸缺血肝損傷［15］、腦 IRI［12］、腎 IRI［18］、心IRI的研究表明，激活Nrf2可增加組織SOD含量及活性。這可能是Nrf2減輕IRI損傷的機(jī)制之一。

2．4 增加醌氧化物還原酶1(NQO1)表達(dá) NQO1是體內(nèi)的重要抗氧化因子，參與維生素E、輔酶Q、維生素K3的還原，在抗腫瘤、清除重金屬、酚類(lèi)化學(xué)物、減輕器官缺血再灌注方面發(fā)揮重要作用?？寡趸駻RE元件是NQO1的啟動(dòng)元件之一，激活Nrf2/ARE通路可以增加 NQO1表達(dá)，并在腦IRI［12］、腎 IRI［13］中呈現(xiàn)出保護(hù)作用。

2．5 增加硫氧還蛋白(Trx)表達(dá) Trx是一類(lèi)小分子多功能蛋白，與硫氧還蛋白還原酶、NADPH共同組成硫氧還蛋白還原系統(tǒng)。Trx可通過(guò)還原含巰基底物、直接清除自由基、維持GSH還原態(tài)，抑制細(xì)胞凋亡、抑制白細(xì)胞趨化、增加線粒體膜電位來(lái)減輕IRI［19］。Trx是Nrf2的下游基因，激活Nrf2可增加 Trx表達(dá)［20］，這可能是激活Nrf2、減輕IRI的機(jī)制之一。

2．6 抑制通透性轉(zhuǎn)換(MPT) 線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(PTP)是位于線粒體內(nèi)外膜之間非選擇性高導(dǎo)電性通道，生理情況下大部分時(shí)間處于關(guān)閉狀態(tài)，病理情況下，ROS、高Ca2+可導(dǎo)致PTP開(kāi)放，PTP開(kāi)放的過(guò)程稱(chēng)為MPT，此時(shí)分子量＜1．5 kD的分子可自由進(jìn)出線粒體，導(dǎo)致線粒體基質(zhì)滲透壓不平衡、線粒體內(nèi)Ca2+釋放入胞質(zhì)、細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子釋入胞質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或死亡。多種ARE誘導(dǎo)劑可通過(guò)激活 Nrf2抑制 MPT［21］。但抑制MPT是否是Nrf2減輕IRI損傷主要機(jī)制還待研究。

2．7 其他 Nrf2還具有減輕炎癥反應(yīng)的作用。Ichihara等［22］通過(guò)敲除Nrf2基因研究小鼠下肢I(xiàn)R，Nrf2－/－鼠與Nrf2-WT比較，前者炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度更高，黏附分子、MCP-1、TNF-α、血管生成因子mRNA水平更高。ARE經(jīng)典誘導(dǎo)劑SFN則可以激活Nrf2，減輕LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，明顯下調(diào)iNOS、Cox-2，減少 TNF-α、IL-β、IL-6 等 LPS 誘導(dǎo)炎癥因子［23］。Nrf2還具有抗凋亡作用，在 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液中加入t-BHQ預(yù)處理，可明顯激活Nrf2，進(jìn)而增加Bcl-2表達(dá)發(fā)揮抗凋亡作用［24］。Chuanxi用鈷原卟啉(CoPP)處理人心肌干細(xì)胞(hCSCs)，顯現(xiàn)抗凋亡作用，其機(jī)制為CoPP增加hCSCs細(xì)胞內(nèi)HO-1、COX-2 及抗凋亡因子 Bcl2、Bcl2-A1、Mcl-1 的表達(dá)，而這種抗凋亡作用通過(guò)Nrf2 ShRNA沉默Nrf2基因則不復(fù)存在［25］。

Nrf2-ARE信號(hào)通路是機(jī)體重要的防御通路，在心、腎、四肢、腦、神經(jīng)、肺等臟器組織IRI中起保護(hù)作用。Nrf2-ARE減輕IRI的機(jī)制與其編碼的大量抗氧化蛋白以及抗炎、抗凋亡、抑制MPT有關(guān)。預(yù)缺血處理是經(jīng)典的減輕IRI方法，預(yù)缺血處理可以激活Nrf2-ARE通路，但激活Nrf2-ARE通路是否是預(yù)缺血處理發(fā)揮IRI保護(hù)性的根本機(jī)制還有待研究。隨著研究的深入，相信會(huì)找到更為有效的減輕IRI的方法。

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