皮膚間充質(zhì)干細(xì)胞在促進(jìn)皮膚愈合中的作用

吳 實(shí)，鄧列華

干細(xì)胞在疾病治療、發(fā)病機(jī)制的研究等方面具有很大的潛能。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells, MSCs）作為成體干細(xì)胞，在干細(xì)胞治療疾病的發(fā)展中有很大的應(yīng)用前景。皮膚間充質(zhì)干細(xì)胞（SMSCs）具有MSCs 的特性，并因其自身的易獲得性，逐漸成為皮膚病學(xué)研究的熱點(diǎn)。本文就MSCs 特性以及其在皮膚愈合中的應(yīng)用前景進(jìn)行綜述。

1 MSCs

目前，MSCs 的分離、純化技術(shù)幾近成熟，通過標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)室方法，可較容易獲得MSCs。MSCs 具有多種功能，其向中胚層（脂，骨，軟骨母細(xì)胞）細(xì)胞系多向分化特性和免疫抑制特性[1]最具研究?jī)r(jià)值及應(yīng)用前景[2]。

1.1 MSCs的轉(zhuǎn)分化功能

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSCs）具有向軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞系分化的能力。Lohberger 等[3]研究表明，口腔內(nèi)MSCs 在二維和三維培養(yǎng)環(huán)境中具有多向分化潛能，MSCs 符合干細(xì)胞與組織工程學(xué)中關(guān)于上頜面功能重建的要求，因此其在此類疾病的治療中具有較好的應(yīng)用前景。

1.2 MSCs的免疫抑制性

Lohberger 等[3]已報(bào)道證實(shí)絕大多數(shù)MSCs 均具有相同的免疫表型（CD73、CD90 和CD105），但不表達(dá)CD45、CD34、CD14、CD11 和人類白細(xì)胞抗原-DR（HLA-DR）。

MSCs 源性樹突狀細(xì)胞具有免疫抑制功能，Zhao等[4]研究表明，BM-MSCs 能將成熟的樹突狀細(xì)胞分化成特殊調(diào)控的樹突狀細(xì)胞群，MSCs 誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞難以刺激T 細(xì)胞的增生。Xu 等[5]研究表明，在體外由MSCs 衍生而來的細(xì)胞能抑制T 細(xì)胞抗原受體（TCR）激活-誘導(dǎo)的T 細(xì)胞增生。從MSCs 培養(yǎng)中得到的條件培養(yǎng)液具有抗CD3 效應(yīng)。另外，MSCs能通過可溶性因素和細(xì)胞間接觸來發(fā)揮其免疫抑制作用。

Han 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，MSCs 在體外能抑制主要和次要的同種免疫反應(yīng)。主要同種免疫反應(yīng)中，MSCs能抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生和增生。它們?cè)隗w外也抑制CD44+記憶T 細(xì)胞的增生和產(chǎn)生。另外，MSCs 在鼠皮膚移植模型中抑制同種異體移植排斥。

Pradier 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在受傷組織中有活性的MSCs 對(duì)炎癥反應(yīng)和免疫細(xì)胞具有免疫抑制潛能， MSCs 可分泌可溶性遞質(zhì)，如NO、前列腺素E2、吲哚胺2,3-雙加氧酶和白介素（IL）-6，這些能抑制T 細(xì)胞的增生和B 淋巴細(xì)胞向漿細(xì)胞分化，保護(hù)細(xì)胞毒T 細(xì)胞的產(chǎn)生及干擾樹突狀細(xì)胞的分化和成熟。

2 SMSCs

SMSCs 是MSCs 中的一種類型，相比于表皮和毛囊，真皮也許是成體干細(xì)胞最大的儲(chǔ)存器[8]。MSCs 來源于皮下組織，并具有多向分化潛能[9]，這使SMSCs 成為皮膚病學(xué)近年的研究熱點(diǎn)之一。

2.1 SMSCs的基本特性

2001 年， Toma 等[10]首次對(duì)SMSCs 進(jìn)行研究，并第一次從真皮層中分離多功能成體干細(xì)胞，這些細(xì)胞可在體外分化為脂肪細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等。SMSCs是間充質(zhì)干細(xì)胞的一種，其基本特性為轉(zhuǎn)分化和免疫抑制。

2.2 SMSCs的培養(yǎng)與分離

Park 等[11]對(duì)4 例患者行頭頸部手術(shù)，在中下頜處獲得1 塊5 cm×2 cm 大的橢圓形皮膚樣本，在剔除毛發(fā)及皮下脂肪組織后，將表皮與真皮組織剪成1 ～3 mm2的外植體，并將外植體加入1 ml 的DME 培養(yǎng)基（DMEM）/F12（1∶1）中。培養(yǎng)基中還添加了10%的小牛血清、10 ng/ml 表皮生長(zhǎng)因子、10 ng/ml 基礎(chǔ)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、100 U/ml 青霉素和100 mg/ml 鏈霉素。將培養(yǎng)基在37 ℃含有5%CO2的組織培養(yǎng)箱中放置3 ～5 d。移除非貼壁細(xì)胞和組織，每周換液2 次。當(dāng)貼壁細(xì)胞有80%群集時(shí)可進(jìn)行分離[12]。Park 等[11]運(yùn)用0.25%（w/v）胰蛋白-乙二胺四乙酸進(jìn)行分離后，加入含有10%FBS、100 U/ml 青霉素和100 mg/ml 鏈霉素的ADME 培養(yǎng)基（ADMEM）中，將培養(yǎng)基放置在37 ℃含有5%CO2的組織培養(yǎng)箱中，每周換液2 次，傳代3 次后便可進(jìn)行分離。

2.3 SMSCs的分子標(biāo)志

Campanati 等[13]從銀屑病患者皮膚樣本中分離出MSCs，研究發(fā)現(xiàn)這些MSCs 有著間質(zhì)樣細(xì)胞的免疫表型，其中HLA-ABC、CD73、CD90 和CD105陽性， 而HLA-DR、CD14、CD19、CD34 和CD45陰性。Vaculik 等[14]研究發(fā)現(xiàn)SMSCs 經(jīng)免疫組化染色后，表達(dá)CD73/CD90/CD105、CD271 和SSEA-4表型。所以可以運(yùn)用CD271 和SSEA-4 表型來分離成纖維細(xì)胞和SMSCs。另外皮膚CD271 高表達(dá)的人群中SMSCs 分化成脂肪、成骨和軟骨形成細(xì)胞的潛能是增加的。相反，SSEA-4 高表達(dá)的人群中SMSCs分化成脂肪形成細(xì)胞的潛能是減弱的。這就說明具有不同分化潛能的特定細(xì)胞群可從人類皮膚中分離出來。

3 SMSCs在皮膚修復(fù)中的研究前景

3.1 SMSCs與BM-MSCs在皮膚修復(fù)中的相似性

SMSCs 和BM-MSCs 均為MSCs，有著相似的形態(tài)、相同的免疫表型以及分化成多種間質(zhì)細(xì)胞系的潛能。Ock 等[15]將豬的BM-MSCs 與人耳和胎兒SMSCs 進(jìn)行比較，結(jié)果顯示兩者的磷酸酶活性、分化能力、Oct-4、Sox-2 蛋白的表達(dá)和mRNA 水平相似。BM-MSCs 比SMSCs 的細(xì)胞周期長(zhǎng)，但是兩者的G0/G1 并沒有明顯的區(qū)別。除了CD29 和CD90，絕大部分細(xì)胞均能表達(dá)CD45。Vaculik 等[14]通過流式細(xì)胞儀分析顯示，SMSCs 的顯型與BM-MSCs 的顯型相似。

BM-MSCs 雖常用于皮膚愈合治療的研究[16]，但BM-MSCs 需行骨髓穿刺才能獲得細(xì)胞，而SMSCs僅需通過皮膚組織活檢便可獲得皮膚樣本細(xì)胞。因此，SMSCs 較BM-MSCs 容易獲得，且兩者均是MSCs，具有很強(qiáng)的相似性。SMSCs 的易獲得性為SMSCs 在皮膚修復(fù)研究中的應(yīng)用提供了很好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

3.2 BM-MSCs在皮膚修復(fù)中的研究現(xiàn)況

皮膚愈合是指損傷皮膚局部組織細(xì)胞增生、分化以及細(xì)胞基質(zhì)形成的過程。Li 等[17]報(bào)道稱內(nèi)源性BM-MSCs 能向損傷部位移行并參與修復(fù)過程。在移行過程中BM-MSCs 能產(chǎn)生調(diào)控因子、信號(hào)分子（包括受傷部位的化學(xué)趨化因子）等。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β 與堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）的協(xié)同作用能促進(jìn)BM-MSCs 向創(chuàng)傷部位的移行和聚集[18]。另外，Xu 等[5]研究發(fā)現(xiàn)如果將少量MSCs 注入小鼠體內(nèi)，這些細(xì)胞能促進(jìn)異體移植皮瓣的存活。

3.2.1 促進(jìn)表皮生長(zhǎng)及血管增生 Kuo 等[19]建立糖尿病小鼠模型，并在小鼠背部皮膚形成6 cm×5 cm的損傷，再給予BM-MSCs治療。與對(duì)照組相比，經(jīng)過BM-MSCs治療后的實(shí)驗(yàn)組小鼠傷口面積變小，且完全愈合時(shí)間縮短。組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組小鼠皮損局部炎癥反應(yīng)減少，CDE45表達(dá)受到抑制。組織病理學(xué)顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠的表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、脯氨酰4-羥化酶和抑制常數(shù)-67表達(dá)均為強(qiáng)陽性。

急性皮膚全層皮膚損傷（FTSW）是指有大范圍的燒傷或是高能量引起的皮膚創(chuàng)傷，但目前的臨床療效尚不理想。Ma 等[20]建立的小鼠FTSW 模型中，BM-MSCs 能促進(jìn)創(chuàng)傷的愈合，植入BM-MSCs 的小鼠，其損傷部位的上皮邊緣向內(nèi)生長(zhǎng)，并且有膠原形成。角蛋白10 和角質(zhì)纖絲聚集蛋白的聚集顯示，BM-MSCs 在創(chuàng)傷部位參與了表皮分化的早期及中期階段。

皮膚放射綜合征（CRS）是指對(duì)暴露部位皮膚進(jìn)行高劑量電離輻射后產(chǎn)生的遲發(fā)性損傷。Agay 等[21]建立 CRS 小型豬模型，將小型豬在高劑量電離輻射下照射81～222 d后，均能模擬人類CRS潛伏期表現(xiàn)，即早期紅斑、脫發(fā)和干燥（潮濕）脫屑。BM-MSCs能促進(jìn)淋巴細(xì)胞在CRS 小型豬皮損真皮和（或）皮下組織交界處聚集，促進(jìn)血管增生。

3.2.2 軟骨的增生及汗腺的增長(zhǎng) 在皮膚愈合中，軟骨的增生及汗腺的增長(zhǎng)也十分重要。在體外模擬內(nèi)環(huán)境條件下，BM-MSCs 能表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白，并且在軟骨發(fā)生中出現(xiàn)表面凝集及必要的收縮。另組織病理學(xué)顯示，BM- MSCs 在培養(yǎng)了14 d 后具有能表達(dá)硫酸化的葡糖氨基聚糖類和膠原Ⅱ型的群系。在特殊的培養(yǎng)環(huán)境下BM- MSCs 能促進(jìn)軟骨生長(zhǎng)[22]。人胚胎皮膚中內(nèi)在的外胚葉發(fā)育不全（ectodysplasin，EDA）和EDA 感受器的表達(dá)與汗腺的增長(zhǎng)有關(guān)，誘導(dǎo)人BM-MSCs 分化成汗腺細(xì)胞，并通過EDA 基因的轉(zhuǎn)染來實(shí)現(xiàn)汗腺的增生[23]。Cai 等[24]已經(jīng)證實(shí)EDA 基因在汗腺發(fā)展中的重要性，轉(zhuǎn)染了EDA 基因的BM-MSCs 能促進(jìn)汗腺的再生。該作者的研究進(jìn)一步證實(shí)了EDA 改良的間充質(zhì)干細(xì)胞具有對(duì)皮膚和皮膚附屬器燒傷修復(fù)和再生的潛能。

人類BM-MSCs 有加速修復(fù)豬和兔傷口的能力[25]。人體細(xì)胞在兔體內(nèi)不會(huì)引起任何免疫反應(yīng)，可能與兔皮膚存在免疫耐受有關(guān)。

3.2.3 促進(jìn)真皮成纖維細(xì)胞的增生 皮膚愈合包括傷口早期變化、傷口的收縮、肉芽組織增生、瘢痕形成以及表皮與其他組織再生。肉芽組織的形成是愈合過程中關(guān)鍵的一步。肉芽組織存在的基礎(chǔ)是成纖維細(xì)胞和新生血管。成纖維細(xì)胞隨著纖維網(wǎng)遷入創(chuàng)傷部位后，受傷部位的邊緣出現(xiàn)表皮再生，在干擾素（IFN）和TGF等調(diào)控因子作用下，用于皮膚愈合的膠原、纖維蛋白和其他基質(zhì)通過成纖維細(xì)胞為代表的結(jié)締組織進(jìn)行合成，逐漸增加的合成膠原能貫穿整個(gè)創(chuàng)傷部位，隨后成纖維細(xì)胞增生逐漸衰減，以調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)合成和降解的平衡[26]。所以成纖維細(xì)胞是皮膚主要的基質(zhì)細(xì)胞群，它們能通過分泌細(xì)胞外基質(zhì)的前體來保持結(jié)締組織的結(jié)構(gòu)完整。另外，成纖維細(xì)胞還可向損傷部位移行。

Smith 等[27]將人類真皮的成纖維細(xì)胞與鼠BMMSCs 共培養(yǎng)，在共培養(yǎng)之前，先將成纖維細(xì)胞和BM-MSCs 分別單獨(dú)培養(yǎng)3 d 和11 d，得出BM-MSCs能誘導(dǎo)真皮成纖維細(xì)胞的增生，明顯增加成纖維細(xì)胞的數(shù)量。BM-MSCs 能促進(jìn)成纖維細(xì)胞的移行。皮膚抓傷影像顯示，在有BM-MSCs 存在的情況下，皮膚抓傷后1 ～3 d，成纖維細(xì)胞向抓傷處加速移行，到了第3 天，共培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞可導(dǎo)致抓傷處傷口完全閉合，而非共培養(yǎng)的至少要4 d，且兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

MSCs 能對(duì)真皮成纖維細(xì)胞分泌化學(xué)誘導(dǎo)劑。觀察到成纖維細(xì)胞對(duì)MSCs 具有趨化現(xiàn)象。MSCs 能誘導(dǎo)真皮成纖維細(xì)胞調(diào)整有關(guān)細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)定和粘附基因的表達(dá)。 研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比成纖維細(xì)胞ITGA7 mRNA水平上調(diào)，細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）、血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）和MMP11 mRNA水平下調(diào)，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而TGF-β1 與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MSCs 是調(diào)節(jié)真皮成纖維細(xì)胞增生、遷移和基因表達(dá)的信號(hào)來源。

4 結(jié)語

目前，MSCs 已被用于皮膚愈合的研究中，基于MSCs 的特性，還可將其應(yīng)用于皮膚疾病的治療研究。Campanati 等[13]將兩種TNF-α 抑制劑(依那西普和阿達(dá)木單抗)作用于銀屑病患者皮膚來源的MSCs，以觀察其療效，結(jié)果表明接受TNF-α 治療的患者皮膚樣本中的MSCs 比未接受治療的患者生長(zhǎng)慢。Salvolini 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，人類SMSCs 細(xì)胞質(zhì)表達(dá) VEGF，細(xì)胞核表達(dá)3 種一氧化氮合酶(NOS)亞型，因此能夠分泌VEGF 和NO，它們能促進(jìn)上皮細(xì)胞的增生和增加血管通透性。

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