Myo5a末端4個(gè)小片段重組質(zhì)粒的構(gòu)建

游荷花，沈敬華(山西醫(yī)科大學(xué)汾陽(yáng)學(xué)院病免教研室，汾陽(yáng) 0300;內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室)

Myo5a，是肌球蛋白的重鏈12條(MYH12)，染色體定位為:15q21。肌球蛋白為一種馬達(dá)蛋白，能將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為機(jī)械能，參與包括肌肉收縮、胞質(zhì)分裂、胞飲作用、趨化性、信號(hào)傳導(dǎo)及靶向小泡運(yùn)輸?shù)仍趦?nèi)的多種細(xì)胞活動(dòng)，在細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸中發(fā)揮重要作用。肌球蛋白共分為18類(I－XⅧ )，Myo5a屬于這個(gè)大家族中的第五個(gè)家族MyosinⅤ中的一員。最近的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Myo5a可能與一些腫瘤的發(fā)生有關(guān)［1］。為進(jìn)一步研究Myo5a與腫瘤的關(guān)系，本研究設(shè)計(jì)構(gòu)建4個(gè)Myo5a末端特異性小片段的原核表達(dá)重組質(zhì)粒PGEX-4T-3/Myo5a，并進(jìn)行了一系列鑒定，為研究Myo5a的作用提供研究工具。

1 材料與方法

1.1 材料

DNA模板 Myo5a，PGEX-4T-3原核表達(dá)載體，DH5α大腸桿菌菌株均為本室保存。T4DNA連接酶，BamHⅠ、XhoⅠ等 DNA限制性內(nèi)切酶均為Takara公司產(chǎn)品。膠回收試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒是AXYGEN公司產(chǎn)品。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

據(jù)GenBank的人Myo5a基因全序列，設(shè)計(jì)了4對(duì)引物來(lái)擴(kuò)增Myo5a羧基端4個(gè)大小100 bp左右的小片斷(見(jiàn)表1)。其中上游引物設(shè)計(jì)含有BamHⅠ的酶切位點(diǎn)，下游引物設(shè)計(jì)含有XhoⅠ的酶切位點(diǎn)。4個(gè)小片斷被分別命名為 down1、down2、down3、down4。

1.3 PCR擴(kuò)增Myo5a羧基端四個(gè)特異性小片斷

冰上將 0.5 μl 的 Myo5a DNA 模板，2 μl 的down1 引物，1 μl的 dNTP，0.5 μl的 DNA 聚合酶(Vent酶)，5 μl的緩沖液，41 μl的雙蒸水構(gòu)成 50 μl體系加入PCR管中。先預(yù)變性:95℃2 min，然后變性:95℃15 s，后退火50℃30 s，后延伸:72℃45 s，此三步循環(huán)30次。最后4℃保溫。

擴(kuò)增down2、down3、down4重復(fù)以上操作即可，只是PCR體系中的引物換作對(duì)應(yīng)引物，退火溫度down4與down1相同，均為50℃。down2、down3退火溫度為54℃。

1.5 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定被擴(kuò)增產(chǎn)物。得到所需擴(kuò)增片段后使用RCR純化試劑盒提純DNA。

1.4 目的基因的克隆

用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切先前得到的4個(gè)PCR產(chǎn)物和PGEX-4T-3質(zhì)粒載體，膠回收試劑盒純化酶切后的產(chǎn)物。之后在4℃冰箱用T4 DNA連接酶將4個(gè)Myo5a基因小片段與PGEX-4T-3質(zhì)粒載體按適宜比例相連接過(guò)夜。取連接反應(yīng)液分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH 5α感受態(tài)細(xì)胞，后將菌液均勻涂布于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平皿上，37℃培養(yǎng)12－16 h。

1.5 篩選與鑒定重組質(zhì)粒

1.5.1 PCR鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒 從上述四種LB培養(yǎng)基上每種隨機(jī)挑取數(shù)個(gè)菌落，做好標(biāo)記之后分別接種LB液體培養(yǎng)基中(其中含氨芐青霉素)，劇烈振搖，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。第2天從各管中分別取菌液以對(duì)應(yīng)引物做PCR反應(yīng)。經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳作PCR產(chǎn)物鑒定，能擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)Myo5a特異性小基因片段者為陽(yáng)性重組質(zhì)?？寺?。

1.5.2 酶切鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒 用質(zhì)粒小量提取試劑盒對(duì)經(jīng)PCR篩選、鑒定正確的陽(yáng)性重組質(zhì)?？寺√崛≈亟M質(zhì)粒DNA，然后用BamHⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，鑒定目的基因是否插入載體中，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.6 基因序列測(cè)定鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒

北京諾塞基因組研究中心有限公司使用雙脫氧鏈終止法全自動(dòng)測(cè)序儀對(duì)PCR鑒定及酶切鑒定均正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增Myo5a羧基端4個(gè)特異性小片斷

以人Myo5a基因全序列為模板，用PCR技術(shù)擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致四對(duì)約100 bp左右的DNA片段，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 篩選與鑒定重組質(zhì)粒

2.2.1 重組質(zhì)粒的PCR鑒定 對(duì)LB平皿上隨機(jī)挑取的菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.2.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定 圖3是先選取了PGEX－4T-3/Myo5a-down3重組質(zhì)粒的4個(gè)陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒后，4個(gè)陽(yáng)性克隆分別經(jīng)BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳鑒定得到了圖中2－5泳道中的結(jié)果，1泳道為雙酶切空載體PGEX-4T-3作對(duì)照的結(jié)果。1泳道位置略低于重組質(zhì)粒，且無(wú)小片段DNA釋放，2－5泳道有150 bp左右DNA小片段釋放。圖4是其余三種重組質(zhì)粒也各選取四個(gè)陽(yáng)性克隆經(jīng)BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切的結(jié)果。1－4泳道為PGEX-4T-3/Myo5a-down1的雙酶切的結(jié)果，均有130 bp左右DNA小片段釋放。5－8泳道為PGEX-4T-3/Myo5a-down2的雙酶切的結(jié)果，均有100 bp左右 DNA小片段釋放。9－12泳道為PGEX-4T-3/Myo5a-down4的雙酶切的結(jié)果，最后兩泳道有小片段釋放。9，10兩泳道無(wú)小片段釋放，說(shuō)明這兩個(gè)陽(yáng)性克隆不正確。

將鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果證明其基因序列與預(yù)計(jì)的DNA基因序列完全一致。證明down1、down2、down3、down4基因片段已被成功克隆到PGEX-4T-3載體中，即四種重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

3 討論

Myo5a是由頭部、頸部、尾部三個(gè)功能部位組成，構(gòu)成一“Y”字形結(jié)構(gòu)。其中尾部較短，頸部較長(zhǎng)，而與運(yùn)輸物質(zhì)有關(guān)的是尾部頂端的位點(diǎn)［2］。MyosinⅤ的頸部區(qū)域較長(zhǎng)，大約24 nm［3］，因而步子比較大。最近研究表明，MyosinⅤ類蛋白在無(wú)中間絲的情況下，運(yùn)動(dòng)“步伐”會(huì)變大、同時(shí)速度也會(huì)變快，提示中間絲網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)所形成的黏滯力有可能阻礙了細(xì)胞器間的運(yùn)輸［4］。實(shí)驗(yàn)證明，提純的腦肌球蛋白Va在電鏡下看到是雙頭聚合體［5］。研究發(fā)現(xiàn)，老鼠肌球蛋白Ⅴ免疫缺陷時(shí)表現(xiàn)為皮膚顏色變淡，受影響的老鼠還會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)問(wèn)題，幾周后就會(huì)死亡，分析認(rèn)為皮膚顏色變淡是因?yàn)楹谏仡w粒從黑色素細(xì)胞到發(fā)光毛發(fā)運(yùn)輸?shù)娜睋p所致［6－8］。這表明肌球蛋白Ⅴ在黑色素運(yùn)輸中是很重要的。也有實(shí)驗(yàn)證實(shí)人類“Griscelli病”是因?yàn)镸yosinⅤ基因突變導(dǎo)致了輕色素沉著，共濟(jì)失調(diào)以及各種免疫缺陷和神經(jīng)系統(tǒng)的癥狀［9］。因此推斷認(rèn)為肌球蛋白Ⅴ在細(xì)胞內(nèi)主要負(fù)責(zé)有被小泡和黑色素等微粒的運(yùn)輸，當(dāng)這種馬達(dá)發(fā)生故障時(shí)就會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)等方面的疾?。?0］。近幾年又發(fā)現(xiàn)Myo5a與一些腫瘤的發(fā)生可能有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)用PCR克隆擴(kuò)增出4個(gè)Myo5a末端基因片段的蛋白編碼序列，用BamHⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切后，將此片段插入原核表達(dá)載體pGEX-4T-3，構(gòu)建重組 子 PGEX-4T-3/Myo5a-down1，PGEX-4T-3/Myo5adown2，PGEX-4T-3/Myo5a-down3，PGEX-4T-3/Myo5adown4。先后用PCR、限制性酶切和基因測(cè)序來(lái)證實(shí)得到的是我們所需的重組質(zhì)粒，為后續(xù)研究Myo5a的作用提供研究工具，從而可以深入研究非常規(guī)肌球蛋白在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的作用及其調(diào)控分子機(jī)制。

［1］ Komori Y，Iwane AH，Yanagida T.MyosinV makes two Brownian 90 degrees rotations per 362nm step ［J］.Nat Struct Mol Biol，2007，14(10):968－973.

［2］ Thirumurugan K，Sakamoto T，Knight PJ，et al.The cargo-binding domain regulates structure and activity of myosin 5 ［J］.Nature，2006，442(7099):212－215.

［3］ Levi V，Gelfand VI，Serpinskaya AS，et al.Melanosomes transported by myosinV in Xenopusmelanophores perform slow 35 nm steps［J］.Biophys J，2006，90(1):L07－L09.

［4］ Kural C，Serp inskaya AS，Chou YH，et al.Tracking melanosomes inside a cell to study molecular motors and their interaction［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104(13):5378－5382.

［5］ Liu J，Taylor DW，Krementsova EB，et al.Three-dimensional structure of the myosin V inhibited state by cryoelectron tomography［J］.Nature，2006 ，442(7099):L07－208－211.

［6］ Skold HN，Aspengren S，Wallin M.The cytoskeleton in fish melanophore melanosome positioning［J］.Microsc Res Tech，2009，58(5):464－469.

［7］ Rosenfeld SS，Houdusse A，Sweeney HL.Magnesium regulates ADP dissociation from myosin V ［J］.J Biol Chem，2005，280(2):6072－6079.

［8］ Forgacs，E.Kinetics of ADP dissociation from the trail and lead heads of actomyosin V following the power stroke［J］.J Biol Chem，2007，283(2):766－773.

［9］ Pastural E，Barrat FJ，Dufourcq-Lagelouse R，et al.Griscelli disease maps to chromosome l5a 21 and is associated with mutations in myosin-V gene［J］.Nat Genet，1997，16(3):289－292.

［10］ 陳宗濤.MyosinVc特異性片段的原核表達(dá)及其抗血清的制備［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，30(7):600－602.