心衰大鼠β3AR自身抗體的產(chǎn)生與心肌重塑的關(guān)系

姚 紅，郭海秀，劉慧榮

(1山西醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，太原 030001;2山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室;3首都醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室;*通訊作者，E-mail:liuhr2000@126.com)

心力衰竭(簡稱心衰，HF)是多種心血管疾病發(fā)展到嚴(yán)重或終末階段的病理生理狀態(tài)，是全球范圍內(nèi)造成死亡的重要原因［1］。近20余年間，心衰患者體內(nèi)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了抗 β1/β2腎上腺素受體(β1/β2-AR)抗體、抗肌球蛋白抗體、抗M2膽堿能受體抗體等一系列抗心肌自身抗體，他們對(duì)心肌造成損害作用的研究亦在逐步深入。新近本研究小組證實(shí)，心衰患者體內(nèi)還存在β3腎上腺素受體自身抗體，且其具有受體激動(dòng)劑樣效應(yīng)，可影響心肌細(xì)胞的生物效應(yīng)［2，3］。這些證據(jù)強(qiáng)烈提示，自身免疫損傷可能在心衰發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。但有關(guān)心肌自身抗體的產(chǎn)生機(jī)制卻鮮見報(bào)道。

心肌重塑被認(rèn)為是心衰發(fā)生機(jī)制中的分子細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。隨著心衰發(fā)展過程中心肌重塑不斷加重，推測心肌細(xì)胞抗原數(shù)量及分布位置可能發(fā)生改變，從而促進(jìn)自身抗體的產(chǎn)生。本研究通過腹主動(dòng)脈縮窄法制備心力衰竭大鼠模型，分析大鼠外周血β3AR自身抗體和心肌β3AR表達(dá)水平，探討心衰發(fā)生發(fā)展過程中β3AR自身抗體的產(chǎn)生和心肌重塑的關(guān)系，以期為心衰發(fā)病過程中自身抗體的產(chǎn)生機(jī)制提供試驗(yàn)證據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

純種健康雄性Wistar大鼠(由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供)，10周齡，體重 200－250 g，按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為2組:①心衰模型組(HF組，n=80):實(shí)施腹主動(dòng)脈縮窄術(shù);②偽手術(shù)對(duì)照組(sham組，n=40):僅分離腹主動(dòng)脈而不結(jié)扎縮窄，其他操作與心衰模型組相同。

1.2 主要儀器和試劑

全波長掃描型酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司);RM6240 B型多道生理記錄儀(四川成都儀器廠);β3AR抗原肽段由西安美聯(lián)生物工程公司合成;大鼠β3AR特異性抗體購自Santa Cruz公司。

1.3 主要方法

1.3.1 慢性心力衰竭模型的建立 10%水合氯醛(400 mg/kg體重)腹腔麻醉，常規(guī)備皮消毒，逐層打開腹腔，左側(cè)腎動(dòng)脈上方游離腹主動(dòng)脈長約1 cm，與腹主動(dòng)脈平行放置7號(hào)鈍針頭，將兩者一同結(jié)扎，腎出現(xiàn)缺血外觀，抽出針頭，使腹主動(dòng)脈部分縮窄，狹窄處內(nèi)徑約0.7 mm。大鼠在30℃條件下蘇醒。偽手術(shù)組僅開腹分離腹主動(dòng)脈，穿線不結(jié)扎。

1.3.2 大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測和心臟標(biāo)本分析

分別于手術(shù)后4，8，12和16周隨機(jī)選取實(shí)驗(yàn)大鼠(HF組n=8，sham組n=6)稱量體重后，用25%烏拉坦麻醉，經(jīng)右側(cè)頸總動(dòng)脈插入心導(dǎo)管至左心室，記錄左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末壓(LVEDP)、左心室內(nèi)壓最大收縮率(+d p/d tmax)和最大舒張率(－d p/d tmax)。測定結(jié)束后，迅速取出心臟，沿冠狀面將心臟分為兩部分，一部分置于10%中性福爾馬林固定48 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋，制作4μm組織切片，采用Masson和HE染色于光學(xué)顯微鏡下觀察心肌形態(tài);一部分低溫保存，用于心肌細(xì)胞β3AR測定。

1.3.3 心肌細(xì)胞β3AR含量測定 采用蛋白免疫印跡技術(shù)(Western blot)測定大鼠左心室組織β3AR含量。心肌組織蛋白提取按照膜相/水相蛋白提取試劑盒(TansMem protein isolation system instructions，Applygen Technologies Inc)說明書操作。蛋白含量采用BCA法測定。30μg變性蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠分離后轉(zhuǎn)膜，分別與大鼠β3AR特異性抗體及二抗孵育，采用化學(xué)發(fā)光法測定結(jié)果。

1.3.4 大鼠血清中β3AR自身抗體的測定 分別于術(shù)前及手術(shù)后4周，8周，12周和16周采用剪尾法收集大鼠血液，2 500 r/min離心，分離血清，應(yīng)用ELISA方法檢測 β3AR自身抗體［4］。主要步驟如下:以1μg/ml人工合成β3AR細(xì)胞外第二環(huán)肽段作為包被抗原，按每孔50μl包被96孔ELISA板，5%小牛血清的磷酸鹽緩沖液封板;將待測血清以1∶10稀釋于PMT溶液中，以每孔50μl加于 ELISA板，37℃水浴1 h，棄去上清，PBS-T溶液洗板三次，每次間隔5 min，空干;將生物素化山羊抗大鼠IgG(Sigma)按1∶3 000稀釋于PMT溶液中，以每孔50 μl加于ELISA板，37℃水浴1 h，棄去上清，PBS-T溶液洗板三次，每次間隔5 min，空干;將標(biāo)記有辣根過氧化物酶的鏈霉親和素SA-HRP(Sigma)以1∶4 000的濃度稀釋于PMT溶液中，以每孔50μl加于ELISA板，37℃水浴1 h，棄去上清，PBS-T溶液洗板三次，每次間隔5 min，空干;將新鮮配制的底物ABTS(2 mmol/L)與H2O2(2.5 mmol/L)的混合液以每孔50μl加于ELISA板，37℃水浴30 min;利用酶標(biāo)儀波長λ=405 nm讀取各孔的光密度值(optical density，OD)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)變化

實(shí)施腹主動(dòng)脈狹窄術(shù)后8周，HF組大鼠的LVSP和±d p/d t max均低于sham組，LVEDP高于偽手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);術(shù)后12和16周，心功能障礙無進(jìn)一步加重的趨勢，但與同期偽手術(shù)組相比，各參數(shù)仍有明顯的差異(P＜0.05，見表1)。提示心衰大鼠模型建立成功。

2.2 大鼠心肌形態(tài)學(xué)改變

Masson和HE染色結(jié)合光學(xué)顯微鏡觀察及圖像分析技術(shù)顯示，HF組大鼠隨著時(shí)間的推移，心肌發(fā)生了多病灶的變性病變，伴有淋巴細(xì)胞浸潤;心肌組織發(fā)生明顯的膠原纖維化(圖1，見第165頁)。

2.3 心衰模型形成過程中，心肌細(xì)胞β3 AR的含量改變

與同期sham組大鼠相比，HF組大鼠心肌細(xì)胞β3AR含量在術(shù)后4周已有輕微增加，但差異尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);在術(shù)后8，12 和16周，β3AR的含量一直維持在較高的水平，與同期sham組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見圖2)。

2.4 大鼠血清中β3AR自身抗體的產(chǎn)生和變化規(guī)律

術(shù)后4周，HF組大鼠血清中β3AR自身抗體水平(A值)較同期sham組增高(P＜0.05);術(shù)后8周時(shí)上升達(dá)峰值，保持至12周。術(shù)后16周，HF組大鼠血清中β3AR自身抗體下降，較同期sham組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，見圖3)。

3 討論

β腎上腺素受體(βAR)是交感神經(jīng)系統(tǒng)的重要成員，在調(diào)節(jié)心臟活動(dòng)中發(fā)揮著重要的作用。以前認(rèn)為，心臟僅表達(dá)β1AR和β2AR兩種亞型，發(fā)揮心肌正性變時(shí)、變力和變傳導(dǎo)效應(yīng)。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在人類等多種種屬動(dòng)物的心肌細(xì)胞中也有β3AR的表達(dá)，介導(dǎo)心肌負(fù)性變力效應(yīng)。Moniotte等［5］發(fā)現(xiàn)，心衰患者心肌β3AR表達(dá)水平較正常人上調(diào)2－3倍，而且與之偶聯(lián)的Gi蛋白也上調(diào)。起搏引發(fā)的狗心臟衰竭［6］及異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心衰模型［7］也發(fā)現(xiàn)了心肌β3AR上調(diào)。本研究采用腹主動(dòng)脈縮窄增大左心負(fù)荷的方式成功建立大鼠心力衰竭模型，大鼠在手術(shù)處理8周之后，LVEDP升高，±d p/dtmax顯著下降，出現(xiàn)心肌細(xì)胞肥大、心肌纖維化等心肌重塑表現(xiàn)，同時(shí)證實(shí)心衰大鼠心肌β3AR的表達(dá)明顯增高，并在心衰發(fā)展過程中持續(xù)處于高水平表達(dá)。提示心衰時(shí)β3AR的激活可能在心臟活動(dòng)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，并且推測心衰時(shí)心肌重塑，心肌細(xì)胞β3AR抗原數(shù)量的改變，可能會(huì)激活自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞，促發(fā)相應(yīng)自身抗體的產(chǎn)生。

本研究進(jìn)一步采用人工合成β3AR細(xì)胞外第二環(huán)肽段作為包被抗原，運(yùn)用ELISA技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，心衰大鼠血清中出現(xiàn)了高滴度的β3AR自身抗體。在心衰過程中隨著心臟病理變化的發(fā)展，該抗體呈現(xiàn)一種產(chǎn)生、增強(qiáng)、維持和自然消退的自我消長變化規(guī)律，也就是說，在沒有任何附加干擾因素條件下，單純心力衰竭的病理變化就能引發(fā)β3AR自身抗體的產(chǎn)生。分析β3AR自身抗體和心肌β3AR表達(dá)的變化規(guī)律發(fā)現(xiàn)，在術(shù)后4周大鼠心肌β3AR含量開始升高時(shí)，血清中β3AR自身抗體亦出現(xiàn)較高的滴度;在術(shù)后8周后心肌β3AR含量達(dá)高峰并持續(xù)高含量表達(dá)時(shí)，血清中相應(yīng)自身抗體的含量也達(dá)到高峰，并保持了一定的時(shí)程;但在術(shù)后16周時(shí)，盡管心衰大鼠心肌β3AR依舊高表達(dá)，但其血清中β3AR自身抗體已經(jīng)回落，甚至消失。此結(jié)果提示，心衰發(fā)生時(shí)心肌重塑β3AR表達(dá)增高可能是促進(jìn)β3AR自身抗體產(chǎn)生的因素之一，但在心衰發(fā)展過程中還有其他因素參與了抗β3AR自身抗體的調(diào)節(jié)，值得我們進(jìn)一步研究。

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