不同組織化學(xué)染色在急性心肌缺血猝死鑒定中的應(yīng)用研究

陳 冰，陳 陽，閆宜峰，陶香香，何 雷(皖南醫(yī)學(xué)院病理教研室，蕪湖 400;皖南醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系;弋磯山醫(yī)院病理科)

心源性猝死一直是法醫(yī)學(xué)死因判定上的難點(diǎn)，而急性心肌缺血猝死心肌的病理組織學(xué)診斷是法醫(yī)工作者診斷心源性猝死的關(guān)鍵所在?，F(xiàn)代病理學(xué)技術(shù)的發(fā)展，為急性心肌缺血猝死心肌的病理組織學(xué)診斷提供了較為客觀的檢查方法和觀察指標(biāo)。HE染色在心肌缺血6－12 h后發(fā)現(xiàn)病變，已被大多數(shù)學(xué)者認(rèn)可，但這些病理變化的特異性還有待進(jìn)一步探索。特殊組織學(xué)染色是一種比較實(shí)用的診斷心肌缺血的方法，可以作為常規(guī)技術(shù)廣泛應(yīng)用于法醫(yī)實(shí)踐工作中，Nagar-Olsen染色(蘇木精堿性復(fù)紅苦味酸法)、Heidenhain染色(鐵礬-蘇木素－伊紅染色)，文獻(xiàn)報(bào)道都可用在心肌缺血的早期診斷中。劉英坤等［1］研究報(bào)道Heidenhain染色方法可在早期缺血的心肌纖維出現(xiàn)明顯的反應(yīng)，胡志紅等［2］進(jìn)一步驗(yàn)證和揭示了Heidenhain染色方法的應(yīng)用價(jià)值，也有部分學(xué)者采用Nagar-Olsen染色進(jìn)行心肌缺血的早期診斷［3］。Heidenhain氏蘇木精法染色在操作流程中有別于Heidenhain染色，且用于心肌缺血的早期診斷鮮見報(bào)道。

為了探討準(zhǔn)確的組織學(xué)染色方法對(duì)法醫(yī)檢案實(shí)踐中的診斷及鑒別的幫助作用，進(jìn)一步確定Nagar-Olsen染色、Heidenhain染色、Heidenhain氏蘇木精法染色在急性心肌缺血猝死鑒定中的應(yīng)用價(jià)值，本文采用HE染色、Nagar-Olsen染色、Heidenhain染色(鐵礬－蘇木素－伊紅染色)和Heidenhain氏蘇木精法染色對(duì)28例急性心肌梗死心肌、10例冠心病非心源性猝死心肌進(jìn)行染色，并設(shè)10例正常心肌對(duì)照組作比較性研究，以便尋找到簡(jiǎn)易可行，結(jié)果可靠的染色方法。

1 材料和方法

1.1 材料

所有標(biāo)本均選自我院法醫(yī)鑒定中心2009－2012年來受理的法醫(yī)病理學(xué)檢驗(yàn)案例。死者年齡20－65歲。根據(jù)尸體解剖及HE染色結(jié)果，并結(jié)合法醫(yī)鑒定書，分為3組:①28例急性心肌梗死組，冠狀動(dòng)脈狹窄均為Ⅲ－Ⅳ級(jí)，HE染色可見心肌梗死，經(jīng)全面尸檢排除其他死因。②10例冠心病非心源性猝死組，冠狀動(dòng)脈狹窄為Ⅰ－Ⅳ級(jí)，肉眼及HE染色均未見心肌梗死病灶。③10例對(duì)照組，生前均無心臟病史，解剖也未發(fā)現(xiàn)有心臟器質(zhì)性病變，死因?yàn)轱B腦外傷或機(jī)械性損傷。

1.2 染色方法

1.2.1 HE染色 常規(guī)脫水，浸蠟，包埋、石蠟切片脫蠟至水;蘇木素染色;分化;伊紅染色;脫水、透明、封片。

1.2.2 Nagar-Olsen染色 ①石蠟切片脫蠟至水;②浸入Nagar-Olsen氏蘇木精溶液10－20 s;③流水沖洗5 min;④0.1%堿性復(fù)紅水溶液3 min;⑤蒸餾水洗5－10 s;⑥純丙酮5－10 s;⑦0.1%苦味酸－丙酮溶液分化至無色，約20 s;⑧二甲苯透明，樹膠封固。

1.2.3 Heidenhain染色(鐵礬－ 蘇木素－ 伊紅染色) ①石蠟切片脫蠟至水;②媒染于5%鐵礬液內(nèi)5－7 min，水洗30 s;③蘇木素液中染5－7 min，流水沖洗5 s;在鐵礬液中分色(鏡下控制到正常心肌纖維為無色為止)，流水沖洗5 min;⑤各級(jí)乙醇脫水至95%乙醇時(shí)，酸溶液伊紅復(fù)染;⑥脫水、透明、樹膠封片。

1.2.4 Heidenhain氏蘇木精法染色 ①石蠟切片脫蠟至水;②5%硫酸鐵銨水溶液中媒染60 min;③蒸餾水急洗5－10 s;④放入Heidenhain氏蘇木精溶液內(nèi)60 min;⑤以5%硫酸鐵銨水溶液與蒸餾水1∶1稀釋分化并流水沖洗交替進(jìn)行(鏡下控制);⑥流水沖洗10 min;⑦脫水、透明、樹膠封片。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn)

三種組織化學(xué)染色方法結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)見表1。

HE染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):正常心肌纖維染色為粉紅色，胞質(zhì)、胞核顯示清晰，細(xì)胞膜完整，細(xì)胞排列規(guī)則，細(xì)胞間隙適中。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 19.0軟件包進(jìn)行分析，各組間陽性率比較采用χ2檢驗(yàn)。各種方法比較采用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 HE 染色結(jié)果

對(duì)48例標(biāo)本均進(jìn)行了HE染色，對(duì)照組心肌纖維染色為粉紅色，胞質(zhì)胞核及組織結(jié)構(gòu)清晰;急性心肌梗死組梗死區(qū)心肌纖維凝固性壞死、核碎裂、消失，胞質(zhì)均呈不規(guī)則粗顆粒狀，間質(zhì)水腫，有少量中性粒細(xì)胞浸潤(圖1)，冠狀動(dòng)脈Ⅲ－Ⅳ級(jí)狹窄，部分區(qū)域可見鈣化灶(圖2);冠心病非心源性猝死組，心肌纖維染色為粉紅色，胞質(zhì)胞核及組織結(jié)構(gòu)清晰，冠狀動(dòng)脈Ⅰ－Ⅳ級(jí)狹窄，均未見梗死灶。HE染色顯示只有在梗死區(qū)才會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞核的改變，在非梗死區(qū)心肌纖維表現(xiàn)為細(xì)胞水腫，胞質(zhì)紅染，胞核無明顯病變，與對(duì)照組心肌很難鑒別。

2.2 Nagar-Olsen 染色結(jié)果

Nagar-Olsen染色顯示對(duì)照組心肌呈淺棕色，無艷紅的缺氧心肌存在(圖3);急性心肌梗死組在梗死區(qū)周圍可見心肌呈艷紅色，呈灶狀或片狀分布(圖4);非心源性猝死組大部分心肌呈淺棕色，其中有2例在邊緣區(qū)出現(xiàn)艷紅色。

2.3 Heidenhain 染色結(jié)果

Heidenhain染色顯示對(duì)照組心肌呈紅色，無黑色的缺氧心肌存在;急性心肌梗死組梗死區(qū)大部分心肌纖維胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黑點(diǎn)，呈灶狀或片狀分布(圖5);非心源性猝死組有1例在心外膜下心肌纖維胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黑點(diǎn)，呈點(diǎn)狀分布。

2.4 Heidenhain氏蘇木精法染色結(jié)果

Heidenhain氏蘇木精法染色顯示，對(duì)照組心肌呈棕黃色，心肌纖維胞質(zhì)內(nèi)未見黑點(diǎn);急性心肌梗死組，梗死區(qū)大部分心肌纖維胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黑點(diǎn)，呈灶狀或片狀分布(圖6)，胞核也呈黑色;非心源性猝死組也有1例在心外膜下心肌纖維胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)了黑點(diǎn)。

2.5 不同染色方法在各組表達(dá)的結(jié)果

表2結(jié)果顯示Nagar-Olsen染色、Heidenhain染色、Heidenhain氏蘇木精染色在急性心肌梗死心肌組中陽性表達(dá)率分別為75%，54%和50%;在冠心病非心源性猝死心肌中陽性表達(dá)率分別為20%，10%和10%;在正常心肌組表達(dá)均呈陰性。上述三種方法在以上兩組的陽性表達(dá)率比較未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，但急性心肌梗死心肌組與非心源性猝死組及對(duì)照組陽性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

3 討論

猝死(sudden death)是由于機(jī)體潛在的疾病或重要器官急性功能障礙導(dǎo)致的意外突然的死亡。由于猝死發(fā)生時(shí)的意外性和突然性，且多無醫(yī)生在場(chǎng)，易引起懷疑，故需經(jīng)法醫(yī)解剖鑒定死因［4］。據(jù)我國猝死資料統(tǒng)計(jì)分析，心血管疾病猝死大約占50%－60%，居猝死發(fā)生率之首［5］。其中冠心病是心血管系統(tǒng)疾病中發(fā)生猝死最常見的疾病。對(duì)于冠心病猝死的法醫(yī)學(xué)鑒定，特別要注意尋找心肌缺血性改變，尤其要注意尋找早期心肌缺血的改變。所以，判定早期的心肌缺血，對(duì)心源性猝死的法醫(yī)學(xué)鑒定具有重大的實(shí)際意義。

雖然急性心源性猝死的早期病理改變常規(guī)組織病理學(xué)檢查有時(shí)難以發(fā)現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)改變，但我們對(duì)各組均進(jìn)行了HE染色，旨在確定梗死區(qū)的范圍和觀察梗區(qū)邊緣心肌缺血的病理變化。同時(shí)觀察到細(xì)胞核的改變主要出現(xiàn)在明顯的梗死區(qū)內(nèi)，而在非梗死區(qū)心肌纖維的表現(xiàn)在三組中無明顯差別。因此HE染色在觀察早期心肌缺血方面應(yīng)以胞質(zhì)的變化為主。

尋找更敏感的染色方法，并用于法醫(yī)實(shí)踐中，對(duì)鑒別和診斷早期心肌缺血具有重要的意義。特殊染色具有價(jià)格便宜、操作簡(jiǎn)便易行、結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，不失為一種有價(jià)值的診斷早期缺血的方法，心肌早期缺血改變與正常心肌對(duì)某些色素的著色性質(zhì)不同而呈現(xiàn)不同的色調(diào)，因而可以顯示和判定心肌早期缺血的變化。目前，主要常用于心肌缺血診斷的組織學(xué)染色方法有Nagar-Olsen染色、Heidenhain染色等［6］。而Heidenhain氏蘇木精染色也是一種傳統(tǒng)的染色方法，通常是用于一些較薄的組織的回染。特別是用于細(xì)胞核的染色觀察，能夠清楚地顯示染色體、染色質(zhì)以及細(xì)胞質(zhì)中線粒體的位置。此外，還可以使髓鞘染色，用于心肌早期缺血判定鮮見報(bào)道。

目前對(duì)于這些方法的研究，文獻(xiàn)表明主要是采用其中的一種與HE染色進(jìn)行比較，而且往往是用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［7］。因此本研究對(duì)上述三種染色方法進(jìn)行了比較性研究，本研究發(fā)現(xiàn)，與HE染色比較，在部分HE顯示相對(duì)正常的區(qū)域，Nagar-Olsen染色、Heidenhain染色、Heidenhain氏蘇木精染色都提示有缺氧的心肌的存在;而且急性心肌梗死組與非心源性猝死組及對(duì)照組陽性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，證實(shí)了這三種染色方法在急性心源性猝死的診斷上都具有應(yīng)用價(jià)值。

研究還顯示Heidenhain染色、Heidenhain氏蘇木精染色雖然方法不同，操作步驟不一樣，但結(jié)果基本一致(P＞0.05)，且在急性心肌梗死組中，Heidenhain氏蘇木精染色強(qiáng)陽性率為50%(14/28)，顯著高于Heidenhain染色的強(qiáng)陽性率18%(5/28)。文獻(xiàn)中大多采用的是 Heidenhain染色［8］。其中 Heidenhain染色、Heidenhain氏蘇木精染色經(jīng)過我們反復(fù)實(shí)驗(yàn)，表明在早期缺氧心肌中顯示為細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)黑點(diǎn)，病變的部位主要在心內(nèi)膜下(血管供應(yīng)末端)、心肌細(xì)胞膜及橫紋處(功能代謝強(qiáng))，并未出現(xiàn)文獻(xiàn)報(bào)道的心肌染為黑色［2］。同時(shí)，Nagar-Olsen染色的陽性率(75%)較高，該染色方法較其他兩種方法在操作分化時(shí)較容易控制有關(guān)，但強(qiáng)陽性數(shù)不足，可能與Heidenhain染色、Heidenhain氏蘇木精染色中的蘇木素液與其配制方法不同有關(guān)。Nagar-Olsen染色在梗死區(qū)周圍的心肌顯示為明顯的艷紅色并大致勾勒出壞死的邊緣，有助于確定梗死區(qū)的范圍及面積。

研究結(jié)果顯示，單獨(dú)使用 Nagar-Olsen染色、Heidenhain染色、Heidenhain氏蘇木精染色法在顯現(xiàn)早期心肌缺血方面有可能出現(xiàn)假陽性或假陰性(若對(duì)操作流程中的技術(shù)不熟練，分化掌握不好時(shí)易出現(xiàn))。因此，我們建議采用HE染色結(jié)合Nagar-Olsen染色方法，避免出現(xiàn)假陽性或假陰性，并且有助于確定梗死區(qū)的范圍及面積;或采用HE染色結(jié)合Heidenhain氏蘇木精法染色，強(qiáng)陽性率較高，有助于急性心源性猝死診斷的準(zhǔn)確性。

免疫組化雖也能發(fā)現(xiàn)早期的心肌缺血性改變，但是該方法試劑價(jià)格昂貴，實(shí)驗(yàn)條件要求較高，操作技術(shù)性強(qiáng)，不宜在基層廣泛開展。而組織化學(xué)染色，實(shí)驗(yàn)試劑價(jià)格低廉、易操作，只要嚴(yán)格按操作步驟操作，避免假陽性的發(fā)生，在基層宜推廣。因此，在心肌早期缺血法醫(yī)學(xué)鑒定過程中，采用HE染色結(jié)合Nagar-Olsen染色或HE染色結(jié)合Heidenhain氏蘇木精法進(jìn)行檢測(cè)具有重要的實(shí)用價(jià)值。

［1］ 劉英坤，鐘志，班翔，等.診斷早期心肌缺血三種組織學(xué)染色方法的比較［J］.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，36(3):238.

［2］ 胡志紅，王庭，吳萍.心肌Heidenhain染色在冠心病猝死診斷中的應(yīng)用觀察［J］.九江學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，92(1):46－47.

［3］ 李建宇，李怡，龔海英，等.蕨麻正丁醇提取部位對(duì)小鼠急性心肌缺血損傷的保護(hù)作用［J］.中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2009，7(1):48－52.

［4］ 邵同先，張?zhí)K亞.不同組化染色對(duì)實(shí)驗(yàn)性急性心肌缺血的早期診斷研究［J］.陜西醫(yī)學(xué)雜志，2005，34(4):443－445.

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