乳清蛋白-麥芽糖糊精的Ma i l l a r d反應(yīng)復(fù)合物制備β-胡蘿卜素納米乳液

李 燕，劉成梅，劉 偉，鐘俊楨

（南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌大學(xué)中德食品工程中心，江西南昌330047）

乳清蛋白是牛乳中酪蛋白沉淀后存在于乳清中的蛋白質(zhì)，為全價(jià)蛋白，易于消化吸收，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。乳清蛋白具有一些突出的功能特性，可作為乳化劑、穩(wěn)定劑、保濕劑、起泡劑等應(yīng)用于食品加工中。乳清蛋白的一些特點(diǎn)如易在等電點(diǎn)附近發(fā)生聚合和沉淀，限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[1－2]。通過Maillard反應(yīng)與還原糖類共價(jià)復(fù)合，乳清蛋白的多種性能可得到改善。由于Maillard反應(yīng)的反應(yīng)條件溫和，且無需添加化學(xué)試劑，被視為一種安全、有效的蛋白質(zhì)改性方法。目前對(duì)乳清蛋白與多糖的Maillard反應(yīng)復(fù)合物（Maillard Reaction Products，MRPs）的研究主要集中在提高蛋白質(zhì)乳化能力[1]、乳化穩(wěn)定性[3]及熱穩(wěn)定性[4]等功能上。食品工業(yè)中乳液在應(yīng)用時(shí)往往需要在油相中溶解一些疏水的活性物質(zhì)如β－胡蘿卜素。對(duì)油相中活性物質(zhì)的保護(hù)，在乳液制備中非常重要。相對(duì)小分子乳化劑，蛋白乳化劑能夠更好地保護(hù)乳滴中易降解的物質(zhì)，而蛋白與多糖的MRPs可在提高乳液物理穩(wěn)定性的同時(shí)進(jìn)一步提高油相中β－胡蘿卜素的化學(xué)穩(wěn)定性[5]。因此，本文擬通過在溫和條件下的Maillard反應(yīng)制備WPI與MD的MRPs，將其用于制備β－胡蘿卜素的納米乳液，并考察納米乳液的物理穩(wěn)定性及MRPs對(duì)油相中β－胡蘿卜素是否存在保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

乳清分離蛋白（Whey Protein Isolate，WPI）蛋白含量85%，上海愛蘭比亞營(yíng)養(yǎng)品有限公司；麥芽糖糊精（Maltodextrin，MD）Sigma－Aldrich，USA，DE值16.5～19.5，平均分子量約1000u；玉米油 購自當(dāng)?shù)爻?；β－胡蘿卜素，F(xiàn)luka，USA，純度≥97%；其余試劑 為分析純。

Ultra－Turrax T25 Basic高速乳化分散機(jī) 德國(guó)Janke&Kunkel KG.IKA－werk公司；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；NCJJ－0.2/150超高壓均質(zhì)機(jī) 廊坊通用機(jī)械有限公司；NICOMP 380/ZLS納米粒度儀 美國(guó)PSS公司；CR－10色差儀 日本，柯尼卡美能達(dá)公司。

1.2 乳清蛋白乳液的制備

WPI溶解于磷酸鹽緩沖液（pH7.0，10mmol/L）中，同時(shí)加入0.02%的NaN3，磁力攪拌3h以上，使蛋白充分溶脹，形成水相。一定量的玉米油為油相，在分散機(jī)高速剪切2min制備得到粗乳液，然后在高壓微射流儀中均質(zhì)乳化，得到納米乳液，用于進(jìn)一步分析。

1.3 WPI-MD MRPs的制備[6]

將WPI（5%）與MD（10%）分別溶解于超純水中，磁力攪拌過夜，使溶質(zhì)完全水化。將WPI與MD溶液按照質(zhì)量比1∶2混合，磁力攪拌3h以上，使蛋白和多糖分子充分接觸后凍干。凍干的蛋白多糖混合物置于底部裝有飽和KBr溶液（相對(duì)濕度79%）的玻璃干燥器中，80℃反應(yīng)2h，制備得到WPI－MD的MRPs，所得產(chǎn)物置于－18℃冰箱儲(chǔ)存。

1.4 WPI-MD MRPs接枝度的測(cè)定

參照Habeeb[7]的方法稍作改進(jìn)。取0.3mL蛋白溶液（濃度1mg/mL），加入2mL PBS緩沖液（50mmol/mL，pH8.2）和1mL TNBS溶液，渦旋振蕩混勻，在40℃水浴中避光反應(yīng)2h，然后取出加入1mL 0.1g/100mL的SDS溶液和1mL 0.1mol/mL HCl終止反應(yīng)，室溫下放置30min，于340nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。按照式（1）計(jì)算接枝度。

式中：A0為接枝反應(yīng)前樣品的吸光度；At為反應(yīng)后樣品的吸光度。

1.5 β-胡蘿卜素乳液的制備

稱取一定量β－胡蘿卜素置于玉米油中，避光60℃磁力低速攪拌1h，使其完全溶解，形成油相（β－胡蘿卜素濃度為0.05%）；將乳化劑加入pH3.2，50mmol/L檸檬酸鹽緩沖液中，同時(shí)加入0.02%NaN3用于防腐，磁力攪拌3h以上，使乳化劑完全水化（乳化劑濃度為蛋白當(dāng)量0.5%）。高速剪切攪拌，同時(shí)滴加5%的油相于水相中，9000r/min剪切3min，形成粗乳液。將制備的粗乳液通過高壓微射流儀進(jìn)一步均質(zhì)得到β－胡蘿卜素乳液，將制備乳液迅速避光保存。

制備的β－胡蘿卜素乳液用50mmol/L，pH3.0檸檬酸鹽緩沖液適當(dāng)稀釋，采用NICOMP 380/ZLS納米粒度儀室溫分析乳液粒徑大小（平均粒徑）與分布（多分散系數(shù)，PDI）。

1.6 β-胡蘿卜素含量的測(cè)定

β－胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：準(zhǔn)確稱取20mg β－胡蘿卜素標(biāo)品，以少量氯仿溶解，加入正己烷定容至100mL為1號(hào)母液。取1號(hào)母液4mL置于50mL容量瓶中，定容，得到2號(hào)母液。分別取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL 2號(hào)母液置于容量瓶中，定容至10mL，測(cè)450nm處吸光度。

乳液中β－胡蘿卜素含量測(cè)定[8]：準(zhǔn)確稱取1g乳液，正己烷+乙醇（3∶2）混合溶劑連續(xù)提取3次，合并上相，定容至10mL，以正己烷為參比，測(cè)定450nm處吸光度，結(jié)果通過標(biāo)準(zhǔn)曲線算出。

2 結(jié)果與討論

2.1 WPI乳化性能的考察

分別考察了WPI乳液制備參數(shù)對(duì)WPI乳液物理特性的影響，包括WPI濃度、微射流均質(zhì)壓力、均質(zhì)次數(shù)的影響。

按照1.2的方法制備乳清蛋白乳液（油相質(zhì)量比10%，微射流壓力120MPa，5次循環(huán)），考察WPI穩(wěn)定乳液的粒徑分布隨WPI濃度的變化。如圖1所示，當(dāng)WPI的濃度為0.5%～2.5%時(shí)，隨著WPI濃度的增加，乳滴平均粒徑變小，但變化幅度不大。WPI的濃度大于0.5%時(shí)，蛋白濃度的升高對(duì)乳滴粒徑的減小貢獻(xiàn)不大，這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果類似，即當(dāng)WPI濃度大于0.5%時(shí)，乳液中油水界面被WPI飽和，乳液粒徑變化與WPI濃度無關(guān)[5]。而WPI濃度為0.5%，乳液較易分層，為MRPs對(duì)乳液穩(wěn)定性的提高提供了提升空間，因此本文采用蛋白當(dāng)量濃度為0.5%進(jìn)行β－胡蘿卜素納米乳液的制備。隨著WPI濃度的升高，乳液的PDI值變化不大，即所得乳液隨WPI濃度升高其分布均勻性變化不大，進(jìn)一步表明乳液油水界面在WPI為0.5%時(shí)已基本被蛋白分子飽和。

當(dāng)WPI濃度0.5%，油相5%，微射流5次循環(huán)時(shí)，考察微射流均質(zhì)壓力對(duì)納米乳液粒徑的影響，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明固定循環(huán)次數(shù)為5次，隨著微射流均質(zhì)壓力增大，乳滴粒徑逐漸減小。當(dāng)壓力大于166MPa時(shí)，乳滴的粒徑變化不大，但PDI值明顯減小。乳狀液屬于動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定體系，高壓均質(zhì)能夠?yàn)槿橐禾峁┮欢ǖ哪芰枯斎?，使乳液分散體系能夠在一定時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定。隨著輸入功率的加大（即均質(zhì)壓力和均質(zhì)次數(shù)的共同影響），乳滴粒徑先下降后上升[9]。而本文的結(jié)果并未呈現(xiàn)這一趨勢(shì)，可能是由于在本文的實(shí)驗(yàn)條件下，均質(zhì)過程輸入的功率并未達(dá)到破壞乳液穩(wěn)定性的臨界值。盡管在高壓區(qū)乳液有較小的粒徑，較窄的粒徑分布，考慮到壓力過大會(huì)加速β-胡蘿卜素的降解，應(yīng)選用低壓段制備β-胡蘿卜素納米乳液。當(dāng)均質(zhì)壓力為60MPa時(shí)，乳滴平均粒徑為330nm（一般納米乳液的平均粒徑小于500nm），可視為納米乳液，因此選用60MPa為制備β-胡蘿卜素納米乳液的工作壓力。

當(dāng)WPI濃度0.5%，油相5%，微射流壓力60MPa時(shí)，考察微射流均質(zhì)次數(shù)對(duì)納米乳液粒徑的影響，結(jié)果如圖3所示，均質(zhì)次數(shù)對(duì)乳液平均粒徑影響不大，但PDI值波動(dòng)較大。當(dāng)均質(zhì)次數(shù)小于三次時(shí)，PDI值極不穩(wěn)定，說明乳液體系未能形成較為穩(wěn)定的分散系統(tǒng)。當(dāng)均質(zhì)次數(shù)大于或等于三次時(shí)，乳液的PDI值相對(duì)較為穩(wěn)定。同樣考慮到過大的輸入功率加速敏感物質(zhì)的降解，選用均質(zhì)次數(shù)為3次，制備β-胡蘿卜素納米乳液。

2.2 WPI-MD的MRPs的制備

將制備得到的WPI-MD MRPs（HWMD）與凍干WPI（WPI）、同樣條件下加熱的WPI（HWPI）、凍干的WPI與MD的混合物（WMD）相比。凍干WPI呈白色片狀疏松結(jié)構(gòu)。加熱后的WPI疏松度降低，顏色變化不大。WPI與MD的凍干混合物呈白色粉末，結(jié)構(gòu)比較緊實(shí)。而WPI-MD的MRPs結(jié)構(gòu)更為致密，顏色為淡黃褐色，說明發(fā)生了Maillard反應(yīng)。

由于Maillard反應(yīng)發(fā)生于還原糖上的羰基與ε-氨基之間（蛋白質(zhì)中主要為賴氨酸），所以蛋白質(zhì)的接枝度可以通過測(cè)其游離氨基酸含量進(jìn)行表征。如表1所示，WPI、HWPI的接枝度未檢出（原始WPI與HWPI游離氨基酸含量無顯著差異。本文以原始WPI的游離氨基酸含量為參照計(jì)算接枝度，因此WPI與HWPI樣品的接枝度視為未檢出），而MRPs具有高達(dá)44.8%的接枝度。此外，結(jié)果顯示，WPI與MD混合物亦有高達(dá)9.1%的接枝度，說明有可能在凍干、混合過程發(fā)生了一定程度的Maillard反應(yīng)。

2.3 β-胡蘿卜素乳液的制備與表征

β-胡蘿卜素對(duì)光及其敏感，熱穩(wěn)定性較好，需要在避光加熱條件下使其充分溶解于油中。

2.3.1 β-胡蘿卜素乳液的物理穩(wěn)定性 如圖4所示，納米乳液具有一定的物理穩(wěn)定性。WPI與HWPI的物理穩(wěn)定性相差不大。樣品制備后立即測(cè)定，MD的加入可顯著降低乳液的平均粒徑（p＜0.05）。僅用WPI為乳化劑時(shí)乳滴平均粒徑高達(dá)410nm，而與MD的混合物乳滴粒徑為348nm，經(jīng)加熱復(fù)合后，其平均粒徑進(jìn)一步降低為284nm。樣品在40℃避光保存40d后，乳液粒徑變化不大，說明形成了較為穩(wěn)定的分散體系。觀察樣品的外觀發(fā)現(xiàn)，HWMD穩(wěn)定的乳液在經(jīng)過40d室溫儲(chǔ)藏后，其濁度隨試管的上下分布基本一致，而其他三個(gè)樣品的下層均出現(xiàn)濁度隨高度變大的現(xiàn)象（數(shù)據(jù)未顯示）。蛋白質(zhì)與多糖的MRPs降低乳液粒徑的結(jié)論多有報(bào)道[1，3，10]。一般認(rèn)為MRPs吸附在油水界面上，連接在蛋白分子上的糖鏈伸入水相中，使界面膜的厚度增加。同時(shí)，包裹與蛋白質(zhì)膜外層的多糖膜可以增加乳滴靠近的立體位阻，從而提高乳液的物理穩(wěn)定性[3]。

2.3.2 β-胡蘿卜素乳液的化學(xué)穩(wěn)定性 考察納米乳液中β-胡蘿卜素的化學(xué)穩(wěn)定性，結(jié)果如圖5所示。WPI-MD的MRPs非但沒有對(duì)包埋其中的β-胡蘿卜素起保護(hù)作用，反而加速了其降解。40℃避光保存40d后，HWMD穩(wěn)定的乳液中β-胡蘿卜素的含量?jī)H為初始含量的7.1%±1.1%。而加熱WPI與WPI-MD的混合物顯示出對(duì)β-胡蘿卜素良好的保護(hù)能力，同樣儲(chǔ)藏條件下，β-胡蘿卜素含量分別高達(dá)30.1%±1.3%和29.0%±1.3%。Xu等[5]用WPI與甜菜果膠的MRPs制備β-胡蘿卜素納米乳液，發(fā)現(xiàn)共價(jià)復(fù)合物穩(wěn)定的乳液體系可大幅提高乳液中β-胡蘿卜素對(duì)光曝、儲(chǔ)藏的化學(xué)穩(wěn)定性，同時(shí)降低乳液的平均粒徑。MRPs中使用的多糖分子鏈越長(zhǎng)，形成的界面膜越厚，對(duì)油相中的物質(zhì)保護(hù)作用應(yīng)該越明顯。本文的使用的MD平均分子量為1000u，遠(yuǎn)小于果膠的分子量，其對(duì)β-胡蘿卜素的保護(hù)作用小于WPI-甜菜果膠是可以預(yù)見的。然而，WPI-MD的MRPs對(duì)β-胡蘿卜素的保護(hù)作用尚不如凍干WPI，說明MRPs對(duì)油相中的β-胡蘿卜素是否存在保護(hù)作用可能并非多糖層的厚度決定，其潛在機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

本文系統(tǒng)考察了乳液制備參數(shù)對(duì)乳液粒徑分布及穩(wěn)定性的影響，同時(shí)制備了WPI-MD的MRPs。以此為基礎(chǔ)，制備了WPI-MD MRPs穩(wěn)定的β-胡蘿卜素納米乳液，并進(jìn)一步考察了乳液的物理穩(wěn)定性及β-胡蘿卜素的化學(xué)穩(wěn)定性。WPI-MD的MRPs能夠顯著降低納米乳液的粒徑，并提高納米乳液的穩(wěn)定性，但并不能同時(shí)提高蛋白乳化劑對(duì)油相中β-胡蘿卜素的保護(hù)作用。相反，WPI-MD的MRPs加速了油相中β-胡蘿卜素的降解，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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