響應(yīng)面法優(yōu)化藜蘆胺的提取工藝

薛 兵，王濤濤，李丹丹，彭業(yè)芳，溫 文，溫輝梁

（南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330047）

藜蘆[1-2]（Veratrum nigrum L.）百合科藜蘆屬的植物，多年生草本。我國盛產(chǎn)藜蘆，不同品種的藜蘆生物堿均具有明顯的降壓作用，通常認(rèn)為藜蘆有涌吐風(fēng)痰功效，可治療中風(fēng)痰壅、喉痹不通、癲癇、淋巴管炎等癥。目前國內(nèi)外有研究發(fā)現(xiàn)藜蘆胺具有降血壓、抗癌等活性[3-4]，藜蘆生物堿早被人們發(fā)現(xiàn)具有多種功能和保健作用。國內(nèi)系統(tǒng)研究藜蘆植物生物堿成分的研究較少，本文就藜蘆植物中藜蘆胺進(jìn)行了提取優(yōu)化，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上結(jié)合響應(yīng)面法對(duì)影響藜蘆胺提取量的主要因素進(jìn)行分析，從而確定合適的工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)用原植物藜蘆 購于亳州市常富藥業(yè)銷售有限公司；實(shí)驗(yàn)所用化學(xué)試劑 國藥集團(tuán)天津市永大化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，分析純。

SGWRX-4顯微熔點(diǎn)儀 上海精密科學(xué)儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；JJ-200電子天平 常熟雙杰測(cè)試儀器廠；島津LC-10AT高效液相色譜儀 北京京科瑞達(dá)科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 單因素實(shí)驗(yàn) 以粉碎的藜蘆干燥根20g為原料，進(jìn)行每組單因素實(shí)驗(yàn)，提取時(shí)間1～6h，提取溫度30～80℃，料液比（粉碎的藜蘆根質(zhì)量∶提取液體積）為1∶4～1∶14（g/mL）。

1.2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)藜蘆胺料液比、提取時(shí)間、提取溫度三個(gè)因素與藜蘆胺提取產(chǎn)量進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（見表1），優(yōu)化藜蘆胺提取工藝。通過Design-Expert軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析[5-7]，預(yù)測(cè)藜蘆胺提取最優(yōu)工藝參數(shù)。

1.2.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.2.3.1 藜蘆胺提取量 利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法[8-9]測(cè)定藜蘆胺每批次的提取量。將每次提取的提取液用100mL的容量瓶定容，藜蘆胺標(biāo)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，濃度分別是0.1、0.2、0.5、1、2mg/mL，利用高效液相色譜[10]測(cè)定紫外吸收，得到各濃度紫外吸收峰峰面積積分y（mv），圖1為藜蘆胺標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。測(cè)得每次提取液的紫外吸收峰峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式：y=68.776x+0.3994計(jì)算得到各提取液藜蘆胺的濃度，測(cè)定得到每次提取的藜蘆胺的提取量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取溶劑對(duì)藜蘆胺提取量的影響 料液比1∶9，提取時(shí)間為2.5h，提取溫度75℃時(shí)，考察了甲醇、乙醇（95%）、丙酮和乙酸乙酯做提取溶劑時(shí)對(duì)黎蘆胺提取量的影響，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

由圖2可知，95%乙醇對(duì)藜蘆胺的提取量最大，丙酮次之，乙酸乙酯最差。其原因可能是藜蘆生物堿在95%乙醇中的溶解性要好于其他溶劑，故95%乙醇提取效果最好，考慮到提取的活性物質(zhì)用于食品或藥品，95%乙醇相對(duì)于其他溶劑毒性最小，故選用95%乙醇為提取溶劑。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)藜蘆胺提取量的影響 料液比是1∶9，提取溫度75℃時(shí)，考察了提取時(shí)間為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0h時(shí)對(duì)黎蘆胺提取量的影響，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。

由圖3可知，當(dāng)提取時(shí)間為2h時(shí)提取量最大，3h次之，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，藜蘆胺提取量下降。其原因可能是，當(dāng)提取時(shí)間少于2.0h時(shí)，黎蘆胺沒有完全被提取出來，當(dāng)提取時(shí)間過長(zhǎng)，導(dǎo)致黎蘆胺變性，使其提取量降低，故選擇提取時(shí)間2～3h。

2.1.3 溫度對(duì)藜蘆胺提取量的影響 由圖4可知，料液比是1∶9，提取時(shí)間2.5h時(shí)，隨提取溫度的升高，藜蘆胺的提取量逐漸增加。70～80℃藜蘆胺提取量最大，這說明隨著溫度的提高藜蘆胺在溶劑的溶解性增大，又因?yàn)?5%乙醇的沸點(diǎn)為78.18℃，故選擇提取溫度70～80℃。

2.1.4 料液比對(duì)提取量的影響 提取時(shí)間2.5h，提取溫度75℃時(shí)，由圖5可知隨著料液比從1∶4增大到1∶8，藜蘆胺的提取量增大，繼續(xù)增大料液比，藜蘆胺的提取量下降，其原因可能是隨著料液比的增大，藜蘆胺在溶劑中的溶解度增大，提取的量逐漸增大。當(dāng)料液比1∶8～1∶10藜蘆胺的提取量最大，再增大料液比，藜蘆胺的提取量減少，可能是藜蘆胺隨著料液比的增大產(chǎn)生了損失。因此選擇料液比1∶8～1∶10比較適宜。

2.2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)

對(duì)藜蘆胺提取溫度（A）、時(shí)間（B）和料液比（C）進(jìn)行了三因素三水平響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)共有17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，其中12個(gè)析因點(diǎn)，5個(gè)中心點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

利用Design-Expert 7.1.6軟件對(duì)響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，對(duì)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到的模型為多項(xiàng)回歸方程為：

Y=103.54+0.094A+0.53B+2.46C-0.26AB+1.52AC-0.73BC-5.5A2-3.74B2-5.89C2

為了檢測(cè)以上方程的可靠性，對(duì)方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

從表3可知，以藜蘆胺提取量為響應(yīng)值時(shí)，模型p=0.019＜0.05，表明該二次方程模型顯著。同時(shí)失擬項(xiàng)p=0.5584＞0.1000，不顯著，表明正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以和數(shù)學(xué)模型擬合良好，即可以使用該數(shù)學(xué)模型推測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.3 響應(yīng)面結(jié)果分析

為了考察各個(gè)交互項(xiàng)對(duì)藜蘆提取量的影響，在其他因素固定不變的情況下，利用Design-Expert 7.1.6 Trial軟件對(duì)回歸方程進(jìn)行運(yùn)算，作出交互項(xiàng)的響應(yīng)面圖見圖6。

通過該組圖即可對(duì)任何兩個(gè)因素交互影響藜蘆胺提取量的效應(yīng)進(jìn)行分析和評(píng)估。由圖6-a可知，藜蘆胺提取量隨著提取時(shí)間和提取溫度升高先增大后降低，且提取時(shí)間為2.5h，提取溫度75℃左右時(shí)達(dá)最大值。同理，圖6-b、圖6-c分別在提取時(shí)間2.5h料液比1∶9和提取溫度75℃料液比1∶9左右達(dá)最大值。

為了精確計(jì)算最佳工藝參數(shù)，對(duì)藜蘆胺提取量的回歸方程中三個(gè)自變量分別求偏導(dǎo)并使等于0，可以解方程得最佳工藝參數(shù)：提取時(shí)間為2.15h，提取溫度75.42℃，料液比1∶9.11（g/mL），此時(shí)的藜蘆胺提取量100.911mg

為檢驗(yàn)響應(yīng)面優(yōu)化藜蘆胺提取工藝的可靠性，對(duì)最佳提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，考慮到實(shí)際操作性，優(yōu)化后的提取時(shí)間修正為2.0h，溫度為75.0℃，料液比1∶9（g/mL）時(shí)，得藜蘆胺提取量（98.23±0.015）mg，與模型預(yù)測(cè)值的比較誤差為2.66%，說明運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的模型參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用了響應(yīng)面法以提取時(shí)間、提取溫度、料液比三個(gè)因素對(duì)提取量的影響，各因素對(duì)藜蘆胺提取量均有極顯著影響（p＜0.01），影響順序C（料液比）＞B（提取溫度）＞A（提取時(shí)間）。根據(jù)模型得到的最佳提取條件為提取時(shí)間為2.15h，提取溫度75.42℃，料液比1∶9.11（g/mL），此時(shí)的藜蘆胺理論提取量為100.911mg。采用上述優(yōu)化條件做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，同時(shí)考慮到實(shí)際操作情況，將優(yōu)化后的提取時(shí)間修正為2.0h，溫度為75.0℃，料液比1∶9（g/mL）時(shí)，實(shí)際提取量是98.23mg，與模型預(yù)測(cè)值得比較誤差為2.66%，說明運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的模型參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

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