濃硫酸法制備魔芋葡甘聚糖硫酸酯（K G MS）

熊 波，彭述輝，王志江，林 政，王麗霞，龐 杰，*，姚閩娜

（1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002；2.廣州城市職業(yè)學(xué)院食品系，廣東廣州510405；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642）

魔芋葡甘聚糖（KGM）是葡萄糖和甘露糖分子比為1∶1.5或1∶1.6，通過β-1，4糖苷鍵連接形成的一種高分子多糖[1-3]，具有減肥、降血脂、降血糖等[4-6]功效。然而，由于KGM分子的螺旋結(jié)構(gòu)[7-9]，導(dǎo)致其具有極強的吸水能力，溶于水后極易形成一種高粘度的溶液，使其生物活性得不到充分的利用。為此，越來越多的學(xué)者轉(zhuǎn)向KGM衍生物的制備及其生物活性的研究[10-11]，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過硫酸酯化后的KGM具有抗凝血、抗腫瘤和抑制細菌的生長等多種重要的生理功能，而且其活性與其取代度的大小密切相關(guān)[12]。目前常用的硫酸酯化方法：氯磺酸-吡啶法，其取代度較高，生物活性較好[13-14]，然而氯磺酸為化學(xué)危害品，對人體毒性較大，因此尋求一種取代度較高而且更為安全的魔芋葡甘聚糖硫酸酯化方法是目前急需解決的問題。為此，本文采用濃硫酸法制備魔芋葡甘聚糖硫酸酯（KGMS），應(yīng)用傅里葉紅外光譜分析酯化前后KGM結(jié)構(gòu)的變化，并對其制備工藝進行了優(yōu)化，以獲取具有較高取代度的KGMS。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魔芋葡甘聚糖 購自云南昭通市三艾有機魔芋發(fā)展有限公司；濃硫酸、正丁醇、硫酸鈉、明膠、氯化鋇、三氯乙酸、鹽酸、硫酸銨等 均為分析純。

傅里葉變換紅外光譜儀 德國Bruker公司；紫外可見-分光光度計 日本Hitachi公司；電子分析天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器廠；磁力攪拌器 上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 制備方法 取10mL按一定體積比混合的濃硫酸與正丁醇混合液作為酯化試劑，加入0.125g硫酸銨，攪拌并置于冰水浴中冷卻至0℃，然后緩慢加入一定量魔芋粉，于0℃進行硫酸酯化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，用4mol/L氫氧化鈉中和至pH7.0，然后用蒸餾水透析48h，經(jīng)冷凍干燥后，即得KGMS。

1.2.2 取代度的測定 硫酸基含量測定：硫酸鋇比濁法[15]。

式中：DS為取代度；S為硫酸根的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.3 紅外光譜分析 將制備好的KGMS加入到KBr粉末中，碾碎并拌勻，用壓片機壓成薄片，然后將壓好的樣品薄片放置在紅外光譜儀中，測定樣品的紅外吸收光譜。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 采用SAS 8.0軟件的響應(yīng)面Box-Behnken實驗設(shè)計系統(tǒng)，對濃硫酸法制備KGMS的實驗結(jié)果進行參數(shù)優(yōu)化，并對優(yōu)化參數(shù)進行統(tǒng)計分析。實驗因素水平及編碼表見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果與分析

2.1.1 濃硫酸與正丁醇體積比對KGMS取代度的影響 從圖1可以看出，隨著濃硫酸與正丁醇體積比的增加，KGMS的取代度迅速增加，當(dāng)濃硫酸與正丁醇體積比達到3∶1后，隨著濃硫酸與正丁醇體積比的進一步增加，KGMS的取代度開始逐漸下降。因此，濃硫酸與正丁醇體積比在3∶1左右會出現(xiàn)取代度的拐點值，該時間點可確定為優(yōu)化工藝水平的中心點，選取2∶1和4∶1為高低兩水平值。

2.1.2 反應(yīng)時間對KGMS取代度的影響 從圖2可以看出，隨著反應(yīng)時間的延長，KGMS的取代度迅速升高；在30min時，酯化取代度達到最高為0.88；隨著反應(yīng)的進一步進行，硫酸酯的取代度逐漸下降。因此，在反應(yīng)時間30min左右可能出現(xiàn)取代度的拐點值，該時間點可確定為優(yōu)化工藝水平的中心點，選取反應(yīng)時間15min和45min為高低水平值。

2.1.3 KGM質(zhì)量對KGMS取代度的影響 從圖3可以看出，KGM質(zhì)量對KGMS的取代度的影響相對較小，隨著KGM質(zhì)量的增加，KGMS的取代度先逐漸增加，當(dāng)達到0.6g以后，由于酯化試劑有效濃度的減少，KGMS的取代度開始逐漸減小?？芍?，在KGM質(zhì)量為0.6g左右可能出現(xiàn)取代度的拐點值，因此可確定該質(zhì)量為優(yōu)化工藝水平的中心點，選取0.5g和0.7g為高低兩水平值。

2.2 響應(yīng)面設(shè)計結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果 根據(jù)Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計原理，選擇濃硫酸與正丁醇體積比X1、反應(yīng)時間X2及KGM質(zhì)量X33個因素，設(shè)計了3因素3水平的響應(yīng)面分析實驗，實驗結(jié)果見表2。

使用SAS 8.0軟件對表2的結(jié)果進行處理與分析，得到KGMS取代度的二次擬合回歸方程為：

表3為回歸分析結(jié)果，回歸方差分析顯著性檢驗表明，該模型回歸極顯著（p＜0.01），并且模型復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.9592，Radj2=0.8858，說明模型與實際擬合較好，可用于KGMS取代度的理論預(yù)測。

方差分析的結(jié)果還表明：X1、X2項對模型的影響極顯著，項對模型的影響也達到了顯著水平，但各因素的交互作用的影響都不顯著，說明各因素之間的交互作用影響很小。

各因素的F值可以反映出各因素對實驗指標(biāo)的重要性，F(xiàn)值越大，表明對實驗指標(biāo)的影響越大，即越重要。由表3可知，各因素對KGMS取代度的影響程度大小順序為：X1＞X2＞X3，即濃硫酸與正丁醇體積比＞反應(yīng)時間＞KGM質(zhì)量。

2.2.2 工藝條件的驗證 根據(jù)響應(yīng)面Box-Behnken系統(tǒng)擬合的回歸曲線，分別求3個自變量的一階偏導(dǎo)，解方程得到濃硫酸法制備KGMS的最佳條件為：濃硫酸與正丁醇體積比為3.22∶1，反應(yīng)時間為33min，KGM質(zhì)量為0.59g，回歸曲線預(yù)測值為0.94。

為了檢驗響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化條件制備KGMS，重復(fù)3次測得KGMS的取代分別為：0.89、0.97、0.92，平均值為0.93，與理論預(yù)測值十分接近。

2.3 紅外光譜分析

從圖4可以看出，KGM和KGMS在3431、2957、1632、1383cm-1都有吸收峰，這些是多糖的特征吸收峰，其中3431cm-1處為-OH伸縮振動吸收峰，2957cm-1處為-CH2或CH3的C-H伸縮振動吸收峰，1632cm-1處為C=O的伸縮振動吸收峰，1383cm-1處為C-O的伸縮振動吸收峰。而經(jīng)過硫酸酯化反應(yīng)后，KGMS還分別在1257、814cm-1處形成了新的吸收峰，這些都是硫酸酯的特征吸收峰，其中1257cm-1附近的吸收峰是-OSO3-的S=O伸縮振動吸收峰，814cm-1處為C-O-S的伸縮振動吸收峰。這與高三俊等[12]的研究結(jié)果是一致的，證明硫酸基已與KGM結(jié)合形成KGMS。

3 結(jié)論

3.1 本研究采用濃硫酸法對KGM進行硫酸酯化，與氯磺酸-吡啶法相比，所使用的化學(xué)試劑毒性較弱，對人體的危害性較小，而且反應(yīng)較為溫和，因此更適于KGMS的生產(chǎn)。

3.2 本研究控制濃硫酸與正丁醇總體積為10mL，通過單因素實驗和響應(yīng)面分析法，對KGMS的制備工藝進行了優(yōu)化，確定了KGMS的最佳生產(chǎn)工藝條件為：濃硫酸與正丁醇體積比3.22∶1，反應(yīng)時間33min，KGM的質(zhì)量0.59g。在此條件下，得到的KGMS取代度平均值為0.93。

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