血型抗體濃縮技術(shù)在溶血性輸血反應(yīng)檢測(cè)中應(yīng)用

陳肇杰，孫愛(ài)農(nóng)，馮廣滿，曾桂勝，梁勇明（.中山市黃圃人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東中山 5849；.中山市紅十字中心血站，廣東中山 58403）

血型血清學(xué)試驗(yàn)是目前診斷溶血性輸血反應(yīng)（HTR）的主要方法，其中最為重要的是ABO血型抗體及不規(guī)則抗體檢測(cè)，但多數(shù)已有HTR臨床癥狀患者多次檢測(cè)仍為陰性結(jié)果，可能與標(biāo)本中血型抗體濃度低，不能促使紅細(xì)胞出現(xiàn)凝集反應(yīng)，無(wú)法檢出血型抗體有關(guān)。若能在輸血前檢出低濃度的血型抗體可有效預(yù)防HTR。本研究評(píng)價(jià)了低濃度血型抗體濃縮技術(shù)在ABO血型抗體及不規(guī)則抗體檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值，結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 血清標(biāo)本1 500份采集自有輸血、流產(chǎn)或妊娠史患者，輸血反應(yīng)患者，輕度HTR患者及輸血前患者。

1.2 儀器與試劑 LDZ4－018自動(dòng)平衡微型離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）。不則抗體篩查紅細(xì)胞（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型）、抗IgG、抗IgM和抗C3單價(jià)血清（上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司），凝聚胺試劑（中山生科公司）。A、B、O細(xì)胞、含抗IgM（抗－M、N、S）、抗IgG（抗－D、E）血清由中山市中心血站提供。正反定型為A、B、AB型的血清采集自無(wú)輸血、流產(chǎn)、妊娠史的體檢健康者。

1.3 方法 （1）海藻糖－聚乙二醇（PEG）法濃縮血型抗體：配制海藻糖濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol／L、PEG 400濃度為0.075mol／L的海藻糖－PEG濃縮液。將1mL血清與1mL海藻糖－PEG濃縮液混合，室溫孵育30min的同時(shí)混勻，3 000 r／min離心20min，棄上清液，加pH7.2磷酸鹽緩沖液至0.1 mL即為濃縮后血清。經(jīng)前期試驗(yàn)，最終選擇海藻糖濃度為0.2mol／L、PEG 400濃度為0.075mol／L的海藻糖－PEG濃縮液。（2）血清濃縮前后效價(jià)測(cè)定：將IgG抗－D加入AB型血清，按1∶1、1∶2、1∶4、1∶8配制不同效價(jià)IgG抗－D型血清。用海藻糖－PEG法濃縮不同效價(jià)IgG抗－D型血清各3份，抗A、抗B血清各20份，以AB型血清與O型紅細(xì)胞作陰性對(duì)照。用生理鹽水稀釋原血清和濃縮后的抗A、抗B血清，用PBS稀釋濃縮IgG抗－D型血型抗體血清，用鹽水法、凝聚胺法檢測(cè)血清與相應(yīng)紅細(xì)胞的凝集反應(yīng)，以紅細(xì)胞出現(xiàn)1＋凝集為最終效價(jià)。（3）效價(jià)為1∶1各類型稀釋后血清的海藻糖－PEG法濃縮效果：用AB型血清配制各種效價(jià)為1∶1血清，其中人源IgG抗－D 5份、IgG抗－E 3份，IgM 抗－M、N、S各3份，IgM抗A、抗B血清各5份。各種效價(jià)為1∶1血清與AB型血清稀釋1～5倍，配制不同稀釋度血清，每份稀釋血清與相應(yīng)細(xì)胞用凝聚胺法重復(fù)測(cè)定3次凝集效果。用海藻糖－PEG法濃縮各稀釋血清后，用鹽水法、凝聚胺法測(cè)定凝集效果，每份稀釋血清重復(fù)測(cè)定3次。（4）分別用凝聚胺法檢測(cè)有輸血、流產(chǎn)、妊娠或輸血反應(yīng)史患者、輕度HTR患者及輸血前患者1 500份原血清和海藻糖－PEG法濃縮血清的不規(guī)則抗體，記錄檢測(cè)結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS10.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α＝0.05，P＜0.05為比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

IgM（抗A、抗B）效價(jià)升高（4.63±2.19）倍，IgG（IgG抗－D各稀釋液）效價(jià)升高（2.92±1.26）倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t′＝3.74，P＜0.05）。效價(jià)1∶1各類型稀釋后血清用常規(guī)方法未檢出血型抗體，用海藻糖－PEG法濃縮后檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。1 500份未處理的患者血清未檢出不則抗體，海藻糖－PEG法處理后檢出3例IgG抗－D（孕婦）和3例IgG抗－E（曾多次輸血，輕度HTR患者）。

表1 效價(jià)1∶1各類型稀釋后血清海藻糖－PEG法處理后檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

PEG為一種多聚體，可增強(qiáng)紅細(xì)胞抗原與抗體反應(yīng)的敏感性，低濃度PEG則可用于紅細(xì)胞抗體提純［1－2］。文獻(xiàn)［3］研究表明：海藻糖可維持包括單克隆抗體在內(nèi)的多種生物活性物質(zhì)的活性。筆者經(jīng)以前期研究為基礎(chǔ)，構(gòu)建了海藻糖－PEG血型抗體濃縮技術(shù)，其中海藻糖的應(yīng)用是為了延長(zhǎng)濃縮后紅細(xì)胞抗體的保存時(shí)間。本研究結(jié)果表明，海藻糖－PEG血型抗體濃縮技術(shù)可使IgG型血型抗體效價(jià)升高2～4倍、IgM型血型抗體效價(jià)升高2～6倍，二者升高倍數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），可能是由于IgM型血型抗體相對(duì)分子質(zhì)量較大，與譜細(xì)胞結(jié)合力強(qiáng)，而IgG型血型抗體相對(duì)分子質(zhì)量小，需在介質(zhì)作用下才可結(jié)合譜細(xì)胞。

HTR通常由輸注ABO血型不符紅細(xì)胞和不規(guī)則抗體引起的同種免疫反應(yīng)所致。隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，由血型不合引起的輸血反應(yīng)已極為罕見(jiàn)，而不規(guī)則抗體引起的HTR國(guó)內(nèi)時(shí)有報(bào)道［3］。最常見(jiàn)的不規(guī)則抗體有 Rh系統(tǒng)抗－D、抗－E和MNS系統(tǒng)［3－5］。本研究結(jié)果表明，規(guī)則抗體（抗－A、抗B）和不規(guī)則抗（IgG抗－D、E，IgM抗－M、N、S及抗C3）經(jīng)1～3倍稀釋后，常規(guī)方法檢測(cè)不與紅細(xì)胞出現(xiàn)凝集反應(yīng)，而經(jīng)海藻糖－PEG法處理后，可與相應(yīng)的紅細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的凝集反應(yīng)。此外，海藻糖－PEG法血型抗體濃縮技術(shù)有助于檢出低濃度規(guī)則抗體和常見(jiàn)不規(guī)則抗體，且重復(fù)性良好，可有效避免HTR的發(fā)生。

本研究中，1 500份不同類型血清常規(guī)方法均未檢出不規(guī)則抗體，而用海藻糖－PEG法濃縮血清后檢出3例IgG抗－D和3例IgG抗－E不規(guī)則抗體。有研究報(bào)道5 982例輸血患者不規(guī)則抗體檢測(cè)陽(yáng)性率為0.27%［6－7］。不規(guī)則抗體多為IgG類抗體，該類抗體初次產(chǎn)生時(shí)效價(jià)較低，但隨著免疫次數(shù)增多，抗體效價(jià)逐漸增強(qiáng)，可導(dǎo)致嚴(yán)重的HTR。本研究結(jié)果表明，海藻糖－PEG法血型抗體濃縮技術(shù)可檢出血清標(biāo)本中低濃度的不規(guī)則抗體，具有重要臨床應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，海藻糖－PEG法血型抗體濃縮技術(shù)操作簡(jiǎn)便，有助于提高血型抗體檢測(cè)靈敏度，能為HTR提供診斷依據(jù)及有效減少和避免HTR的發(fā)生。

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