“金絲4號(hào)”棗大小孢子發(fā)生及雌雄配子體發(fā)育

鄒 鋒 ，袁德義 ，段經(jīng)華 ，廖 婷 ，馮延芝 ，高 超

（1.中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟(jì)林育種與栽培國家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410004；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院，北京 100091）

“金絲4號(hào)”棗Ziziphus jujubeMill cv ‘jinsi No. 4’原產(chǎn)于山西運(yùn)城龍居鄉(xiāng)東辛莊一帶，是從“金絲2號(hào)”自然雜交的實(shí)生棗樹中選育而來，為棗樹中稀有的名貴鮮食品種[1]。“金絲4號(hào)”耐瘠薄，適應(yīng)性強(qiáng)，自19世紀(jì)80年代對(duì)棗進(jìn)行良種選育和資源開發(fā)利用以來，“金絲4號(hào)”已逐步推廣到全國十余個(gè)省、市及地區(qū)。“金絲4號(hào)”以早實(shí)、果實(shí)特大、皮薄肉厚、清香甜脆、風(fēng)味獨(dú)特著稱，受到人們的重視和消費(fèi)者的歡迎。其鮮果含糖量22.75%，含酸量0.368%，含Vc 2.92 mg·g-1，可食率達(dá) 97.3%，營養(yǎng)豐富，品質(zhì)上等。

棗樹在林業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整、山區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和林產(chǎn)品外貿(mào)出口中占有特殊重要的地位，被稱為“木本糧食”、“鐵桿莊稼”[2]。棗在生產(chǎn)中普遍存在結(jié)實(shí)率低、產(chǎn)量低的現(xiàn)象，這嚴(yán)重影響著棗的經(jīng)濟(jì)效益及其產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前，關(guān)于棗的研究多集中在引種栽培[3]、果實(shí)品質(zhì)[4-5]、病蟲害防治[6]、遺傳多樣性[7]等方面，而關(guān)于棗結(jié)實(shí)率低的生殖生物學(xué)因素的研究報(bào)道較少[8-13]。植物的有性生殖過程是植物體進(jìn)行物種延續(xù)和種群擴(kuò)大的根本動(dòng)力。開花、傳粉、受精、結(jié)實(shí)，是一個(gè)連續(xù)的過程，只有從整體的和發(fā)育的角度去研究探討，才能找出問題所在。而大、小孢子發(fā)生及雌、雄配子體的發(fā)育狀況是果樹授粉受精和果實(shí)產(chǎn)量形成的基礎(chǔ)。因此，本研究中試圖通過對(duì)“金絲4號(hào)”棗大小孢子發(fā)生及雌雄配子體發(fā)育過程進(jìn)行觀察，為揭示棗結(jié)實(shí)率低的內(nèi)在原因提供理論依據(jù)，為提高棗產(chǎn)量和品質(zhì)以及開展雜交育種研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)材料采自中南林業(yè)科技大學(xué)衡陽棗種質(zhì)資源圃，試驗(yàn)地位于東經(jīng) 112°18′54″、北緯26°54′48″、海拔70.0 m的緩坡丘陵紅壤。試驗(yàn)地水肥條件良好，采取常規(guī)管理方式。

選取正常開花結(jié)果的8年生“金絲4號(hào)”3株，從2010～2011年每年的4～6月，每3天采樣1次，每次從采樣樹冠中部的不同棗吊的基部選取大小發(fā)育情況較為一致的“金絲4號(hào)”花芽或花蕾10個(gè)，用FAA（70%酒精90 mL、醋酸5 mL、福爾馬林5 mL）固定、抽氣，后轉(zhuǎn)入70%酒精置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。石蠟切片方法參考袁德義等[14]的方法，鐵釩-蘇木精染色，曙紅對(duì)染，加拿大中性樹膠封片，OLYMPUS BX-51顯微鏡下觀察照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 花藥壁的發(fā)育

從“金絲4號(hào)”棗花芽的石蠟切片中可以觀察其花藥壁的發(fā)育過程。首先，形成棗花藥原始體；花藥原始體隨后形成孢原細(xì)胞（見圖1A），孢原細(xì)胞的典型特征是原生質(zhì)濃厚，形成的場所位于花藥四角；孢原細(xì)胞形成之后，通過平周分裂的方式形成2層細(xì)胞；初生造孢細(xì)胞隨即形成（見圖1B），即孢原細(xì)胞分裂而成的2層細(xì)胞中里面的1層細(xì)胞；外面的1層為初生壁細(xì)胞，它經(jīng)過數(shù)次分裂后形成花藥壁，花藥壁形成時(shí)為小孢子母細(xì)胞時(shí)期，花藥壁從結(jié)構(gòu)上分為4層，從內(nèi)至外分別是中層、絨氈層、藥室內(nèi)壁、表皮，次生造孢細(xì)胞位于絨氈層內(nèi) （見圖1C）。另外，絨氈層細(xì)胞和中層會(huì)隨著發(fā)育進(jìn)程而發(fā)生變化。中層在小孢子母細(xì)胞開始減數(shù)分裂時(shí)染色變深開始退化，到“金絲4號(hào)”棗花粉成熟時(shí)只留下殘跡。在“金絲4號(hào)”棗花藥壁發(fā)育過程中，絨氈層內(nèi)含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，能夠?yàn)樾℃咦拥陌l(fā)育奠定充足的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此在花藥整個(gè)發(fā)育過程中表現(xiàn)得最為活躍，這與何春燕[15]的研究結(jié)果類似。絨氈層在“金絲4號(hào)”棗小孢子母細(xì)胞處于減數(shù)分裂時(shí)，其開始徑向加厚（見圖1D）；在“金絲4號(hào)”棗進(jìn)入小孢子四分體時(shí)期，它開始出現(xiàn)原位解體現(xiàn)象（見圖1F）；絨氈層在“金絲4號(hào)”棗單核小孢子時(shí)期，會(huì)繼續(xù)解體，結(jié)果導(dǎo)致與花藥壁的中層剝離（見圖1J、K）；當(dāng)“金絲4號(hào)”棗花粉趨于成熟時(shí)，絨氈層開始溶解、退化，直至消失，“金絲4號(hào)”棗花藥壁由原來的4層只剩下2層，即藥室內(nèi)壁和表皮（見圖1O），根據(jù)Davis[16]對(duì)被子植物花藥壁發(fā)育方式的分類，花藥壁發(fā)育類型分為簡化型、基本型、雙子葉型和單子葉型4種，“金絲4號(hào)”棗花藥壁的發(fā)育屬于基本型。Davis[16]根據(jù)絨氈層發(fā)育后期的形態(tài)差別，將絨氈層分為腺質(zhì)絨氈層和變形絨氈層這2種類型[17]，由于“金絲4號(hào)”棗絨氈層的退化、溶解發(fā)生之后，因其發(fā)生場所位于原位上，所以其核、質(zhì)也在原位溶解，并沒有發(fā)生位置上的移動(dòng)，從而決定著“金絲4號(hào)”棗的絨氈層屬于前一種類型，即為腺質(zhì)型絨氈層，這與攸縣油茶[18]的絨氈層類似。

2.2 小孢子發(fā)生及雄配子體發(fā)育

2.2.1 小孢子發(fā)生

從花藥的橫切面上看，“金絲4號(hào)”的花藥具有4個(gè)花粉囊，中間有藥隔隔開，整體形狀呈蝴蝶狀（見圖1C）。由此可見，對(duì)于“金絲4號(hào)”的幼嫩花藥而言，其結(jié)構(gòu)組成包括初生壁細(xì)胞和造孢細(xì)胞 （見圖1A、B）。對(duì)于造孢細(xì)胞，在其發(fā)育過程中，會(huì)有多次的有絲分裂，并分化形成小孢子母細(xì)胞，造孢細(xì)胞的特點(diǎn)是細(xì)胞體積較大、細(xì)胞核較大、細(xì)胞質(zhì)濃厚、無明顯的液泡；初生壁細(xì)胞在經(jīng)過平周分裂和垂周分裂后形成3個(gè)細(xì)胞層，即藥室內(nèi)壁、中層、絨氈層，并與表皮一起組成花藥壁（見圖1C）。小孢子母細(xì)胞進(jìn)行2次減數(shù)分裂，如減數(shù)Ⅰ末期（見圖1D），減數(shù)Ⅱ末期（見圖1E），其胞質(zhì)分裂為同時(shí)型，經(jīng)過2個(gè)連續(xù)的減數(shù)分裂過程后進(jìn)入四分體時(shí)期（見圖1F）。在四分體時(shí)期，4個(gè)小孢子共處于1個(gè)胼胝質(zhì)（見圖1F）的小孢子母細(xì)胞壁內(nèi)，小孢子四分體為四面體形。

圖1 “金絲4號(hào)”棗小孢子和雄配子體的形成和發(fā)育Fig.1 Formation and development of microspore and male gametophyte in Ziziphus jujube Mill cv ‘jinsi No. 4’

2.2.2 雄配子體發(fā)育

“金絲4號(hào)”棗雄配子體發(fā)育是從小孢子開始的，隨著小孢子四分體之間的胼胝開始解體、溶解并消失（見圖1G、H），其小孢子逐漸從四分體中游離出來（見圖1I），形成單核小孢子（見圖1J），這標(biāo)志著其小孢子進(jìn)入了雄配子體的發(fā)育階段，雄配子體階段對(duì)于小孢子的發(fā)育意義重大，小孢子在從四分體中剛釋放出來時(shí)，細(xì)胞壁較薄，細(xì)胞質(zhì)濃厚，細(xì)胞核處于細(xì)胞中央，細(xì)胞的體積總體上還比較?。ㄒ妶D1J）。小孢子在發(fā)育過程中從其周圍的組織或器官中汲取營養(yǎng)成分，從而使得花粉粒體積不斷增大（見圖1K），并發(fā)育形成核物質(zhì)（見圖1L），同時(shí)小孢子體積繼續(xù)增大，細(xì)胞質(zhì)也明顯液泡化，此時(shí)形成單核時(shí)期小孢子（見圖1M）。小孢子經(jīng)過一段時(shí)期生長發(fā)育就會(huì)形成3個(gè)萌發(fā)孔，萌發(fā)孔位于小孢子的表面，是供給小孢子營養(yǎng)物質(zhì)的通道，營養(yǎng)物質(zhì)的來源是絨氈層（見圖1M）。隨著小孢子不斷地吸收絨氈層的水分和養(yǎng)分，其細(xì)胞體積增大，細(xì)胞壁加厚并且細(xì)胞質(zhì)液泡化加劇，接著花粉粒的體積明顯增大（見圖1M），逐漸發(fā)育成為二核花粉（見圖1N），并充滿淀粉、脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)，最終花粉粒發(fā)育成熟（見圖1O）?！敖鸾z4號(hào)”花粉為三角形，具3個(gè)萌發(fā)孔，3溝，成熟花粉為2-細(xì)胞型。

2.3 大孢子發(fā)生與雌配子體發(fā)育

2.3.1 大孢子發(fā)生

根據(jù)“金絲4號(hào)”棗幼嫩花芽橫切面觀察，胚珠原基發(fā)生于子房壁的胎座上（見圖2A），孢原細(xì)胞由珠心表皮下2～3層細(xì)胞分化而來，接著內(nèi)外珠被伸長發(fā)育形成環(huán)狀突起（見圖2B）。緊貼珠心表皮分化出來的孢原細(xì)胞與相鄰細(xì)胞相比體積明顯偏大，核大而明顯，細(xì)胞質(zhì)濃，直接行使著大孢子母細(xì)胞的功能（見圖2C）。大孢子母細(xì)胞開始進(jìn)行減數(shù)分裂，經(jīng)過中期（見圖2D）、后期（見圖2E）、末期（見圖2F），胞質(zhì)分裂為橫向，形成四分大孢子（見圖2G），靠近珠孔端的3個(gè)細(xì)胞退化，合點(diǎn)端功能大孢子體積增大，繼續(xù)進(jìn)行減數(shù)分裂發(fā)育形成單核胚囊（見圖2H）。

2.3.2 雌配子體發(fā)育

單核胚囊為雌配子體發(fā)育的起點(diǎn)，此時(shí)其內(nèi)外珠被已形成。大孢子母細(xì)胞進(jìn)行減數(shù)分裂后形成四分體大孢子，四分體大孢子的排列是以直線型的方式（見圖2G），其中功能大孢子位于合點(diǎn)端，二核胚囊的形成源于單核胚囊的1次有絲分裂，2個(gè)核由于液泡的推移作用分別移向兩極（見圖2I），并再各進(jìn)行1次有絲分裂形成四核胚囊（見圖2J），形成四核胚囊后逐漸拉長直至出現(xiàn)大液泡化，隨后形成八核胚囊（見圖2K），途徑仍是通過每個(gè)核繼續(xù)進(jìn)行的1次有絲分裂。八核胚囊長期存在，因此斷定“金絲4號(hào)”棗的成熟胚囊的完整形態(tài)：1個(gè)卵細(xì)胞、2個(gè)助細(xì)胞（其珠孔端有大液泡）、2個(gè)極核、合點(diǎn)端有3個(gè)反足細(xì)胞（見圖2L～O）。胚囊形成過程表明“金絲4號(hào)”棗為倒生胚珠，雙珠被，厚珠心，胚囊結(jié)構(gòu)為蓼型。

3 結(jié)論與討論

3.1 “金絲4號(hào)”棗胚胎學(xué)特征

“金絲4號(hào)”棗的胚胎學(xué)特征與已報(bào)道的長紅棗[9]、寧夏圓棗[10]、灰棗[13]、酸棗[19]等基本一致?！敖鸾z4號(hào)”棗的花藥4室，花藥壁4～5層，分別為表皮、1～2層藥室內(nèi)壁、中層和腺質(zhì)絨氈層，花藥壁的發(fā)育類型屬于基本型；小孢子母細(xì)胞經(jīng)2次減數(shù)分裂后形成四分體，其孢質(zhì)分裂為同時(shí)型，四分體排列多為正四面體；成熟花粉為2-細(xì)胞型，其花粉為三角形，具3個(gè)萌發(fā)孔，3溝。“金絲4號(hào)”棗雄配子體發(fā)育過程中未發(fā)現(xiàn)大量花粉敗育的現(xiàn)象，說明“金絲4號(hào)”棗花粉雄性可育，這不是棗子結(jié)實(shí)率低的原因。倒生胚珠，雙珠被，其珠心類型為厚珠心；大孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂形成4個(gè)大孢子，呈線形排列，合點(diǎn)端大孢子發(fā)育成為功能大孢子，功能大孢子經(jīng)有絲分裂后形成成熟胚囊具7細(xì)胞8核，胚囊發(fā)育為蓼型。但是，有關(guān)棗胚囊發(fā)育的類型，仍存在爭議。本研究結(jié)果顯示，“金絲4號(hào)”棗胚囊的發(fā)育類型為蓼型，這與Srinivasachar[20]的觀察結(jié)果一致，但是Kaiale[21]、田惠橋[10]認(rèn)為棗胚囊發(fā)育類型是蔥型，這種差異的產(chǎn)生可能與不同棗品種的遺傳特性有關(guān)，具體原因還有待于進(jìn)一步研究。

3.2 “金絲4號(hào)”棗雌雄異熟現(xiàn)象

植物雌雄異熟性是指1株植株或1朵花中的雌蕊和雄蕊成熟時(shí)間不一致或雌雄性功能在時(shí)間上的分離[22]。有關(guān)學(xué)者經(jīng)研究推測，小孢子母細(xì)胞在結(jié)構(gòu)上因有原生質(zhì)道相連，形成了合孢體，從而在營養(yǎng)運(yùn)轉(zhuǎn)、分配等方面形成一個(gè)完整的系統(tǒng)，因此認(rèn)為小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂是同步完成的[17]，而本研究結(jié)果顯示“金絲4號(hào)” 棗小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂不同步，這與油茶[14]類似，分析其原因，一方面可能是品種自身的特性所導(dǎo)致，目前尚未知其它棗品種是否也存在此現(xiàn)象；另一方面可能是營養(yǎng)因素所導(dǎo)致，即胼胝質(zhì)壁形成過早而堵塞細(xì)胞質(zhì)道，養(yǎng)分的運(yùn)轉(zhuǎn)和分配也由此受到了影響。“金絲4號(hào)”棗在5月下旬至6月初開花，開花數(shù)量多，花期較長，氣溫較高，傳粉

昆蟲較多，這非常有利于其傳粉受精和坐果。高等顯花植物小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂大量不同步現(xiàn)象及不同藥室、不同雄蕊的發(fā)育不同步現(xiàn)象等均是一種有效的延長傳粉期的生殖機(jī)制，即雌雄異熟機(jī)制[18]。棗為雌雄同株植物，“金絲4號(hào)”棗在其雌雄蕊發(fā)育時(shí)期存在不同步現(xiàn)象，即雌雄異熟，“金絲4號(hào)”棗的這種雌雄異熟現(xiàn)象主要表現(xiàn)在雄蕊的發(fā)育先于胚囊的形成，這種類型的雌雄異熟現(xiàn)象在油茶[15]和梨[23]上也有發(fā)現(xiàn)。由此說明“金絲4號(hào)”棗是異花授粉或以異花授粉為主的植物，其雌雄配子體的形成和發(fā)育過程正常，這種雌雄異熟機(jī)制在植物界中普遍存在，其目的是促進(jìn)異交或遠(yuǎn)交，限制自交或近交所導(dǎo)致的物種衰退或退化[23-24]。

圖2 “金絲4號(hào)”棗大孢子和雌配子體的形成和發(fā)育Fig.2 Formation and development of megaspores and female gametophyte in Ziziphus jujube Mill cv ‘jinsi No. 4’

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