EML4-ALK融合基因在非小細(xì)胞肺癌的研究新進(jìn)展

李 龍

(長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北荊州434023)

王 夢(mèng)，杜天幸 蔡志強(qiáng)，楊繼元

(長(zhǎng)江大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 荊州市腫瘤醫(yī)院，湖北荊州434000)

肺癌是全球惡性腫瘤導(dǎo)致死亡的最主要原因，每年有超過100萬人死于肺癌［1］。肺癌全球每年新增病例約160萬，其中非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC)約占80%。雖然化療仍是晚期肺癌治療的主要方法之一，但其副作用大，且療效已遇瓶頸。隨著EGFR、VEGFR等研究的不斷深入，以這些特殊分子的靶向治療，因其毒性小，療效突出，現(xiàn)已成為肺癌治療的新熱點(diǎn)。近幾年在非小細(xì)胞肺癌發(fā)現(xiàn)的棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白樣4和間變淋巴瘤激酶融合基因 (EML4-ALK)可能成為繼EGFR、VEGFR后新的研究熱點(diǎn)?，F(xiàn)就EML4-ALK的結(jié)構(gòu)及亞型、檢測(cè)方法、針對(duì)該靶點(diǎn)的最新治療情況以及耐藥狀況進(jìn)行綜述。

1 EML4-ALK融合基因的結(jié)構(gòu)及亞型

棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白樣4(EML4)與間變淋巴瘤激酶兩基因均位于2號(hào)染色體短鏈，分別為P21與P23。2007年，Soda1［2］等將一腺癌患者手術(shù)腫瘤切除組織進(jìn)行擴(kuò)增，在產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)一3296bp組成的DNA，其編碼由1059個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。研究人員對(duì)其蛋白質(zhì)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)其N端為EML4編碼蛋白的一部分，C端為ALK編碼蛋白一部分。故推測(cè)其為兩基因的融合蛋白。Lin［3］等研究發(fā)現(xiàn)EML4-ALK融合基因陽性非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株通過siRNA基因敲除沉默后其生長(zhǎng)受抑制，表明ELM4-ALK融合基因具有致癌作用。

到目前為止有超過9個(gè)不同的EML4-ALK融合基因變體已經(jīng)被確認(rèn)。融合基因的ALK段固定，均為20-29外顯子片段，與EML4外顯子13融合成變體1(variant1)。它與EML4外顯子20融合成變體2(variant2)。它與外顯子6融合成變體3a(variant3a)，外顯子6及11個(gè)氨基酸插入形成變體3b。外顯子14及14個(gè)未知來源的核苷酸插入至ALK外顯子核苷酸50序列區(qū)形成變體4(variant4)。它與EML外顯子2形成變體5(variant5)，與外顯子13形成變體6(variant6)。外顯子14融合至ALK核苷酸13序列區(qū)形成變體7(variant7)，外顯子15與ALK融合形成變體8(variant7)，外顯子18與ALK融合形成變體9(variant9)［4］。9種變體中，最長(zhǎng)見的是變體1與變體3，分別占到33%和29%。不同變體在非小細(xì)胞肺癌中的作用機(jī)制及其作用強(qiáng)度是否有區(qū)別暫時(shí)沒有報(bào)道。

2 NSCLC中的EML4-ALK

Gung Jin［5］等用 RT-PCR對(duì)167例肺癌標(biāo)本 (121例腺癌，46例鱗癌)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)10例(6%)EML4-ALK融合基因陽性，陽性病例在年輕患者更常見 (10.8%VS89.2%，P=0.002)，融合基因更集中表現(xiàn)在女性、非吸煙、腺癌患者中。10例EML4-ALK患者的EGFR、KRAS均為野生型，其中8例為EML4-ALK變體1型，2例為變體3型。

Aliced［6］等采用熒光原位雜交對(duì)141例NSCLC病例 (89例腺癌、41例細(xì)支氣管肺泡癌、4例腺鱗癌、2例鱗癌、5例大細(xì)胞癌)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)19例 (13%)EML4-ALK融合基因陽性，31例 (22%)EGFR突變型，91例EGFR、EML4-ALK雙野生型。對(duì)EML4-ALK融合基因陽性患者與EGFR突變型以及雙野生型比較，三組平均年齡分別是52、66、64歲，EML4-ALK融合基因陽性患者更年輕 (P＜0.001，P=0.005)。EML4-ALK融合基因陽性患者與EML4-ALK、EGFR雙野生型患者比較，EML4-ALK(+)更傾向發(fā)生在不抽煙者 (P＜0.001)。EML4-ALK(+)患者其EGFR基因型均為陰性，沒有重疊。

Wong［7］等采用RT-PCR及免疫組化對(duì)266例 NSCLC患者進(jìn)行分析 (adenocarcinomar209例、lymphatic epithelial carcinoma11例、squamous cell carcinoma 34例、mucosal epithelia carcinoma 12例)發(fā)現(xiàn)EML4-ALK融合基因13例 (4.9%)，其中吸煙者1例，不吸煙者12例，EML4-ALK(+)更傾向發(fā)生于不抽煙者 (P=0.009)，EML4-ALK(+)與EGFR(+)及KRAS(+)不重疊。EML4-ALK(+)平均年齡為59歲，EML4-ALK(-)平均年齡為64歲，EML4-ALK融合基因更傾向于發(fā)生年齡較輕者(P ＜0.018)。

EML4-ALK融合基因更傾向于發(fā)生于肺腺癌，但鱗癌、肺鱗癌、大細(xì)胞癌均有研究者報(bào)道，不吸煙、年輕、女性的、EGFR(-)、KRAS(-)群體其EML4-ALK發(fā)生率更高。

3 EML4-ALK融合基因的檢測(cè)方法

3.1 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) (RT-PCR)

RT-PCR在檢測(cè)NSCLC EML4-ALK融合基因方面具有敏感性高的特點(diǎn)，但往往醫(yī)院的病理標(biāo)本均經(jīng)甲醛固定，其細(xì)胞內(nèi)RNA被大量破壞，導(dǎo)致其靈敏性降低。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)一般采用單管多重技術(shù)，所以其對(duì)未知亞型無法檢出［8］。并且采用PCR技術(shù)假陽性結(jié)果幾率較其他方法幾率增大［9］。

3.2 免疫組化 (IHC)

免疫組化是實(shí)驗(yàn)室經(jīng)典的蛋白質(zhì)檢查方法，其應(yīng)用于EML4-ALK融合基因的檢測(cè)主要原理是檢查融合基因表達(dá)蛋白。IHC檢驗(yàn)結(jié)果與RT-PCR及FISH具有高度重疊性。但由于EML-ALK基因在肺組織表達(dá)不足［10］，低表達(dá)的EML-ALK往往被漏檢，再者IHC不能對(duì)融合基因進(jìn)行亞型分型［11］。

3.3 熒光原位雜交 (fluorescence in sure hybridization，F(xiàn)ISH)

熒光原位雜交是采用基因探針來標(biāo)記ALK兩斷裂端，如果為EML4-ALK融合基因，熒光顯微鏡下顯現(xiàn)綠色和紅色，如果為融合基因陰性，在熒光顯微鏡下顯現(xiàn)黃色［12］。在采用免疫組化檢測(cè)時(shí)，如果EML4-ALK融合基因表達(dá)弱陽性，IHC檢測(cè)結(jié)果為陰性，若使用FISH檢測(cè)法為陽性。由于FISH法的病理標(biāo)本均經(jīng)甲醛固定石蠟包埋，其細(xì)胞組織、細(xì)胞結(jié)構(gòu)廣泛被破壞，易出現(xiàn)假陽性。Thunnissen［13］等研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)免疫組化檢測(cè)為陽性采用FISH檢測(cè)假陰性。

3.4 其他方法

現(xiàn)在沒有檢測(cè)EML4-ALK的金標(biāo)準(zhǔn)，RT-PCR、IHC、FISH各有利弊，IHC與FISH不能區(qū)分亞型變體，RT-PCR理論上可以區(qū)分已知亞型，但是不能檢測(cè)出未知亞型。RACE-PCR技術(shù)解決了RT-PCR不能區(qū)分未知亞型變體的問題，并且能檢測(cè)出其他與ALK融合的基因［14］。

4 針對(duì)EML4-ALK融合基因的治療現(xiàn)狀

ALK與EML4基因融合后，導(dǎo)致ALK胞內(nèi)酪氨酸酶區(qū)持續(xù)活化，促進(jìn)細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致細(xì)胞癌變。這為研發(fā)阻斷ALK受體，阻止其持續(xù)活化的分子靶向藥物提供了理論基礎(chǔ)。Soda［2］等研究發(fā)現(xiàn)肺上皮細(xì)胞表達(dá)EML4-ALK融合基因的轉(zhuǎn)基因小鼠最終發(fā)展成肺腺癌，表明ALK融合基因具有癌基因特性。不同研究均發(fā)現(xiàn)，在NSCLC表達(dá)EML4-ALK融合基因的細(xì)胞株進(jìn)行研究，ALK抑制劑可以通過抑制ALK融合基因的相關(guān)信號(hào)通路起到抑癌作用［15-16］，其抑癌機(jī)制與EGFR抑制劑類似。ALK抑制劑已經(jīng)在體內(nèi)進(jìn)行評(píng)估起到良好的療效，并且作用于產(chǎn)生EML4-ALK的非小細(xì)胞肺癌的異種移植小鼠，導(dǎo)致腫瘤的有效消退。PF-02341066(crizotinib)是目前唯一進(jìn)入III期臨床試驗(yàn)的藥物［17］，這種口服的生物可利用的小分子抑制劑已被證明能夠抑制EML4-ALK(+)細(xì)胞株。GSK2141795現(xiàn)已經(jīng)進(jìn)入一期臨床階段，NVP-TAE684、CEP-28122、AP-26113、NMS-E628已進(jìn)入臨床前試驗(yàn)。

Lazarev I［18］等診治一36歲非吸煙的非小細(xì)胞肺癌，化療失敗，EML4-ALK融合基因陽性，后給予Crizotinib口服300mg/日，治療兩月后評(píng)價(jià)治療緩解。Wang［19］等報(bào)道于就診的1500例非小細(xì)胞肺癌患者中檢測(cè)出含有ALK重排融合基因患者，采用Crizotinib口服治療，如果有效并且穩(wěn)定則繼續(xù)治療，如果疾病進(jìn)展則停止服藥，其平均治療時(shí)間為6.2月。其中CR(完全緩解)數(shù):1例，PR(部分緩解)數(shù):46例，并且NC(并且穩(wěn)定)數(shù):27例。

Zhang［20］等報(bào)道，一非小細(xì)胞肺癌患者，檢測(cè)EML4-ALK融合基因陽性，口服crizotinib 5月后，發(fā)現(xiàn)病情進(jìn)展，取肺癌組織做基因分析，發(fā)現(xiàn)其融合基因有兩處突變 (4374與4493序列區(qū))，基因點(diǎn)突變后，ALK融合蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變與crizotinib親和力下降。培養(yǎng)crizotinib耐藥癌細(xì)胞株，將TAE684作用于此細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞株生長(zhǎng)受抑制。Heuckmann［21］等研究表明不同EML4-ALK融合基因變體對(duì)ALK抑制劑的敏感性不同，HSP90對(duì)EML4-ALK融合基因陽性非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系也有抑制作用，與ALK抑制劑一樣，不同變體對(duì)其敏感性存在差異性，但其耐受機(jī)制不一樣，將ALK抑制劑與HSP90聯(lián)合使用，具有更強(qiáng)的抑制效果。

5 結(jié) 語

現(xiàn)階段化療及放射治療仍是晚期非小細(xì)胞肺癌患者的主要治療手段，但由于其療效欠佳，毒副作用大，人們渴望一理想的治療手段，分子靶向治療是一個(gè)不錯(cuò)的研究方向。EML4-ALK可能是繼EGFR、VEGFR后又一新的治療靶點(diǎn)。目前對(duì)于EML4-ALK融合基因的研究我們主要面臨以下幾個(gè)問題:①EML4-ALK融合基因發(fā)生率低，研究時(shí)需要樣本量大，現(xiàn)缺乏大樣本量的研究報(bào)告。②RT-PCR、IHC、FISH各有優(yōu)缺點(diǎn)，聯(lián)合檢測(cè)可以互補(bǔ)。暫時(shí)沒有檢測(cè)EML4-ALK的金標(biāo)準(zhǔn)。③EML4-ALK融合基因通路機(jī)制尚未完全清楚，它們之間是否相互聯(lián)系及權(quán)重關(guān)系有待進(jìn)一步研究，待通路機(jī)制研究透徹，針對(duì)主要通路機(jī)制或者聯(lián)合通路機(jī)制的藥物更具有針對(duì)性。以上3個(gè)問題將是以后研究的主要方向，以EML4-ALK為治療靶點(diǎn)將是治療NSCLC的新希望。

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