ITRAQ蛋白技術(shù)在消化系腫瘤研究中的應(yīng)用＊

王 鳴 綜述，王志強審校

（中國人民解放軍總醫(yī)院南樓消化內(nèi)鏡診療科，北京100853）

蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略能高通量地、動態(tài)地對比分析健康和疾病不同狀態(tài)下蛋白質(zhì)表達(dá)譜的改變，可有效地應(yīng)用于腫瘤標(biāo)志物的篩選、鑒定、腫瘤分類、治療效果的評價及腫瘤發(fā)生機制等方面的研究，使得腫瘤的診斷、分類、療效評價由過去應(yīng)用單一的腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行判斷發(fā)展成為現(xiàn)在的應(yīng)用蛋白質(zhì)譜或基因表達(dá)譜的改變來進(jìn)行綜合判斷。

蛋白組學(xué)研究技術(shù)中雙向凝膠電泳技術(shù)是目前使用較為廣泛的、發(fā)展最為成熟的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法。雙向凝膠電泳技術(shù)及其他蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)無法進(jìn)行多組樣本的同時研究，也無法進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究，即便是此后出現(xiàn)的同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽技術(shù)也只能對蛋白質(zhì)進(jìn)行相對定量研究。2004年美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司推出了一項新的同位素標(biāo)記技術(shù)：同位素標(biāo)記相對和絕對定量（isobaric tag for relative and absolute quantitation，ITRAQ），可真正實現(xiàn)對蛋白的絕對定量檢測，其關(guān)鍵是iTRAQ試劑。該試劑由三部分組成，一端為指示基團，中間為中性平衡基團，另一端為反應(yīng)基團，指示基團的相對分子質(zhì)量有4種，分別為114.1×103、115.1×103、116.1×103和117.1×103，與之相對應(yīng)的平衡基團相對分子質(zhì)量依次為31×103、30×103、29×103和28×103，4種指示基團及其相對應(yīng)的平衡基團的相對分子質(zhì)量和都為145.1×103，故iTRAQ技術(shù)有4個試劑，即114、115、116、117，可以同時研究4組樣品；而反應(yīng)基團能與氨基酸N端及賴氨酸側(cè)鏈連接的胺標(biāo)記同重元素，亦也可以標(biāo)記修飾后的氨基酸，故可對磷酸化蛋白、糖基化蛋白等翻譯后修飾蛋白進(jìn)行定量、定性研究。ITRAQ聯(lián)合液相串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（liquid chromatography coupled mass spectrum）可同時檢測4組或者8組的樣品，為多個不同時間段的樣品分析、膜蛋白研究、疾病標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)與鑒定提供定量信息，并可為感興趣的目標(biāo)蛋白進(jìn)行絕對定量，且比其他蛋白質(zhì)組學(xué)定量方法更加得敏感［1－3］。iTRAQ技術(shù)的大體流程為：樣品先經(jīng)胰蛋白酶裂解、烷基化、酶解成肽段，隨后用iTRAQ試劑多重標(biāo)簽進(jìn)行差異標(biāo)記，再將標(biāo)記樣本相混合，最后用LC－MS／MS進(jìn)行檢測，檢測后得到的數(shù)據(jù)采用生物信息學(xué)進(jìn)行分析［2］。

本文綜述了iTRAQ技術(shù)在消化系腫瘤研究中的應(yīng)用，主要從標(biāo)志物篩查、腫瘤發(fā)生、發(fā)展機制及腫瘤治療研究三方面進(jìn)行闡述。

1 標(biāo)志物篩查研究

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)早先是主要被應(yīng)用于尋找腫瘤標(biāo)志物，科學(xué)家們期待能夠通過蛋白質(zhì)組學(xué)研究尋找到能夠應(yīng)用于腫瘤診斷、甚至早期診斷的標(biāo)志物。iTRAQ技術(shù)自應(yīng)用來，也是如此。

Pawar等［4］采用了iTRAQ結(jié)合液相質(zhì)譜技術(shù)比較了食管癌及癌旁組織的蛋白差異，共發(fā)現(xiàn)257個蛋白在兩組間存在差異，其中包含一些既往已被證實在食管癌組織中升高的蛋白質(zhì)，如凝血酶敏感蛋白1、骨膜蛋白1及熱休克蛋白70等，此外還發(fā)現(xiàn)并通過免疫組化證實一些新的蛋白在食管癌組織中高表達(dá)，如前列腺血清酸性磷酸酶、網(wǎng)格蛋白1、二硫鍵異構(gòu)酶A4；證實iTRAQ技術(shù)用于尋找腫瘤標(biāo)志物可靠，且能有新的發(fā)現(xiàn)。

Loei等［5］通過對胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS and MKN7分泌物蛋白組學(xué)檢測，并從中篩選出胃癌細(xì)胞分泌蛋白，并對蛋白進(jìn)行免疫組化驗證，發(fā)現(xiàn)顆粒體蛋白（GRN）在胃癌組織中顯著升高，且在血清中得到進(jìn)一步驗證；用血清血清顆粒體蛋白診斷胃癌ROC曲線下面積可達(dá)0.64，認(rèn)為這一指標(biāo)可以用于胃癌診斷。Chong等［6］比較健康人、早期胃癌、晚期胃癌患者血清蛋白差異，發(fā)現(xiàn)血漿C9蛋白在胃癌患者中顯著升高，且在晚期胃癌中升高高于早期胃癌，盲法檢測顯示C9用于診斷胃癌的靈敏度可達(dá)90%，特異度可達(dá)74%，血漿C9檢測有望能夠改善胃癌的篩查。而Chong等［7］同時也通過胃癌動物模型和細(xì)胞系研究，發(fā)現(xiàn)α胰蛋白酶抑制劑H3重鏈在胃癌動物模型血清中顯著升高，隨后在胃癌患者及對照血清中的檢測證實，血清α胰蛋白酶抑制劑H3重鏈可用于胃癌診斷，用于診斷胃癌的靈敏度可達(dá)96%、特異度可達(dá)66%。

在肝癌標(biāo)志物研究中，許多研究者都用iTRAQ技術(shù)通過不同的標(biāo)本路徑入手，得到了很多新的發(fā)現(xiàn)。Chaerkady等［8］從肝癌組織標(biāo)本入手，找到了一些新的蛋白如干擾素誘導(dǎo)蛋白、蛋白乳表皮生長因子8、骨髓相關(guān)分化標(biāo)志物、纖維介素等在肝癌組織中高表達(dá)，而幾乎所有涉及尿素代謝途徑的蛋白都顯著降低，證實定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)用于尋找腫瘤標(biāo)志物是可行的，且有新的發(fā)現(xiàn)。Lee等［9］則選擇血清樣本研究，以和肝癌的起源、進(jìn)展相關(guān)N－聯(lián)聚糖蛋白為篩尋目標(biāo)，采用iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測肝癌和健康人血漿蛋白，找到了14個差異的N－聯(lián)聚糖蛋白，其中玻連蛋白及抗凝血酶Ⅲ在肝癌患者血清中升高，在肝癌組織中也發(fā)現(xiàn)同步升高。除肝癌標(biāo)志物外，Wang等［10］通過對動物肝癌轉(zhuǎn)移腫瘤模型研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)醛醇酶在肝癌轉(zhuǎn)移動物模型組織和血清中升高，并在人肝癌患者血清中得以證實，轉(zhuǎn)醛醇酶用于診斷轉(zhuǎn)移肝癌和非轉(zhuǎn)移肝癌其靈敏度為77.8%，特異度為86.1%。

Jankova等［11］用iTRAQ結(jié)合質(zhì)譜比較了結(jié)腸癌腫瘤黏膜及癌旁正常黏膜的蛋白差異，其中涉及糖酵解、鈣結(jié)合及蛋白酶抑制等方面蛋白在結(jié)腸癌組織中升高，而這些蛋白可能成為結(jié)腸癌的腫瘤標(biāo)志物。為了研究更加精確，得到純度更加高的腫瘤標(biāo)本，通過顯微切割結(jié)腸癌組織獲取結(jié)腸癌細(xì)胞，經(jīng)iTRAQ檢測鑒定發(fā)現(xiàn)嗅球蛋白4在腺瘤及早期結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，Besson等［12］認(rèn)為嗅球蛋白4可能作為早期的結(jié)腸癌標(biāo)志物。以上研究結(jié)果均在組織中得以證實，但未在血清中得以驗證，其結(jié)果作為診斷的標(biāo)志物效果則有待商榷。而Fan等［13］采用iTRAQ技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)檢測結(jié)腸癌及癌旁組織，發(fā)現(xiàn)SEC61β表達(dá)于癌組織中3倍高于癌旁正常組織，研究發(fā)現(xiàn)SEC61β用于診斷結(jié)腸癌的靈敏度可達(dá)79%，特異度可達(dá)75%，這一結(jié)果將來可能改善結(jié)腸癌的臨床診斷。

2 腫瘤機制研究

腫瘤生長受到多種因素的調(diào)節(jié)，其中就受到腫瘤細(xì)胞的分泌蛋白調(diào)節(jié)。iTRAQ蛋白技術(shù)被用于研究胃癌不同分化能力的細(xì)胞系分泌蛋白。研究發(fā)現(xiàn)并已驗證組織蛋白酶S在胃癌細(xì)胞分泌物中高表達(dá)。組織蛋白酶S涉及胃癌細(xì)胞分化遷移侵襲，大約197種蛋白和組織蛋白酶S途徑相關(guān)。組織蛋白酶S與胃癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而這一結(jié)果將為后續(xù)的研究奠定基礎(chǔ)［14］。為研究結(jié)腸癌中Smad4調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子β傳導(dǎo)（TGF－β）途徑，Ali等［15］運用iTRAQ 技術(shù)比較Smad4陰性和Smad4陽性的結(jié)腸癌細(xì)胞系蛋白差異，發(fā)現(xiàn)TGF－β途徑中S100A4蛋白的表達(dá)與Smad4相關(guān)。Ghosh等［16］通過比較結(jié)腸癌淋巴轉(zhuǎn)移細(xì)胞系和原位細(xì)胞系的蛋白差異，發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系中β－連環(huán)蛋白低表達(dá)伴隨鈣結(jié)合蛋白（一種β－連環(huán)蛋白降解蛋白）高表達(dá)；提示鈣結(jié)合蛋白高表達(dá)和腫瘤的高轉(zhuǎn)移相關(guān)，且鈣結(jié)合蛋白高表達(dá)細(xì)胞系細(xì)胞黏附功能降低，這一結(jié)果的發(fā)現(xiàn)將有助于人們更好的理解結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移。類似iTRAQ技術(shù)應(yīng)用于消化系腫瘤機制的研究不多，但隨著研究深入，這類研究會給人們越來越多的驚喜。

3 腫瘤治療探索

肝癌多重耐藥性一直是肝癌治療的障礙，其耐藥的原因錯綜復(fù)雜。iTRAQ技術(shù)比較BEL7402肝癌細(xì)胞系5－FU耐藥和非耐藥細(xì)胞株的蛋白差異，發(fā)現(xiàn)在耐藥細(xì)胞株中ANXA3蛋白高度表達(dá)，有助于進(jìn)一步理解肝癌耐藥原因，為肝癌藥物治療提供新思路［17］。

短鏈脂肪酸被證實能夠通過誘導(dǎo)細(xì)胞成熟，抑制腫瘤細(xì)胞生長，分化及凋亡。Tan等［18］通過比較經(jīng)丁酸鹽短期干預(yù)后的結(jié)腸癌細(xì)胞及未干預(yù)的結(jié)腸癌細(xì)胞蛋白差異，發(fā)現(xiàn)一批與丁酸鹽作用相關(guān)蛋白，這些蛋白涉及腫瘤細(xì)胞生長、凋亡和轉(zhuǎn)移方面，明確丁酸鹽治療結(jié)腸癌的機制，也提供了結(jié)腸癌化療和新藥物治療的新靶點。而Kilner等［19］則通過iTRAQ技術(shù)進(jìn)一步證實短鏈脂肪酸中除丁酸鹽外戊酸鹽、丙酸鹽均有相類似作用，但具體作用方式略有不同。丁酸鹽作用靶點主要在于角蛋白和中間絲，而戊酸鹽位點在β微管蛋白亞型表達(dá)和微管，丙酸鹽則涉及中間絲，這些研究結(jié)果為治療提供了更加明確的方向。抗腫瘤藥物L(fēng)Y294002抑制結(jié)腸癌磷酸肌醇3激酶途徑，但其具體機制一直不明。通過比較結(jié)腸癌細(xì)胞系經(jīng)LY294002處理前后蛋白差異，研究者發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細(xì)胞LY294002處理后氨酰基－tRNA合成酶、分子伴侶及糖酵解酶等顯著減少，而這些酶與P53基因相關(guān)，故LY294002抗血管生成作用可能通過P53基因作用，故抑制P53基因突變在結(jié)腸癌磷酸肌醇3激酶途徑治療中起重要作用［20］。

iTRAQ技術(shù)的出現(xiàn)大大促進(jìn)了蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，但其也存在著一定的缺點性，如：由于iTRAQ試劑幾乎可以與樣本中的所有蛋白結(jié)合，易受樣本中雜質(zhì)蛋白及樣本處理過程中緩沖液污染；因此對待測樣本進(jìn)行預(yù)處理，并盡量減少操作過程中的污染，操作的精細(xì)和質(zhì)量控制尤為重要，另外，iTRAQ試劑昂貴；但無論如何iTRAQ技術(shù)大大促進(jìn)了消化系腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)研究，隨著后續(xù)技術(shù)的完善和研究投入增加，iTRAQ必將更加廣泛地應(yīng)用在消化系腫瘤的各個方面，且研究將會更加的精細(xì)和完善。

［1］ Wiese S，Reidegeld KA，Meyer HE，et al.Protein labeling by iTRAQ：a new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research［J］.Proteomics，2007，7（3）：340－350.

［2］ Zieske LR.A perspective on the use of iTRAQ reagent techno1ogy for protein complex and profiling studies［J］.J Exp Bot，2006，57（7）：1501－1508.

［3］ Aggarwal K，Choe LH，Lee KH.Shotgun proteomics using theiTRAQ isobaric tags［J］.Brief Funct Genomic Proteomics，2006，5（2）：112－120.

［4］ Pawar H，Kashyap MK，Sahasrabuddhe NA，et al.Quantitative tissue proteomics of esophageal squamous cell carcinoma for novel biomarker discovery［J］.Cancer Biol T－h(huán)er，2011，12（6）：510－522.

［5］ Loei H，Tan HT，Lim TK，et al.Mining the gastric cancer secretome：identification of GRN as a potential diagnostic marker for early gastric cancer［J］.J Proteome Res，2011，11（3）：1759－1772.

［6］ Chong PK，Lee H，Loh MC，et al.Upregulation of plasma C9protein in gastric cancer patients［J］.Proteomics，2010，10（18）：3210－3221.

［7］ Chong PK，Lee H，Zhou J，et al.ITIH3is a potential biomarker for early detection of gastric cancer［J］.J Proteome Res，2010，9（7）：3671－3679.

［8］ Chaerkady R，Harsha HC，Nalli A，et al.A quantitative proteomic approach for identification of potential biomarkers in hepatocellular carcinoma［J］.J Proteome Res，2008，7（10）：4289－4298.

［9］ Lee HJ，Na K，Choi EY，et al.Simple method for quantitative analysis of N－linked glycoproteins in hepatocellular carcinoma specimens［J］.J Proteome Res，2010，9（1）：308－318.

［10］Wang C，Guo K，Gao D，et al.Identification of transaldolase as a novel serum biomarker for hepatocellular carcinoma metastasis using xenografted mouse model and clinic samples［J］.Cancer Lett，2011，313（2）：154－166.

［11］Jankova L，Chan C，F(xiàn)ung CL，et al.Proteomic comparison of colorectal tumours and non－neoplastic mucosa from paired patient samples using iTRAQ mass spectrometry［J］.Mol Biosyst，2011，7（11）：2997－3005.

［12］Besson D，Pavageau AH，Valo I，et al.A Quantitative Proteomic Approach of the Different Stages of Colorectal Cancer Establishes OLFM4as a New Nonmetastatic Tumor Marker［J］.Mol Cell Proteomics，2011，10（12）：M111.

［13］Fan CW，Chan CC，Chen KT，et al.Identification of SEC61βand its autoantibody as biomarkers for colorectal cancer［J］.Clin Chim Acta，2011，412（11／12）：887－893.

［14］Yang Y，Lim SK，Choong LY，et al.Cathepsin S mediates gastric cancer cell migration and invasion via a putative network of metastasis－associated proteins［J］.J Proteome Res，2010，9（9）：4767－4778.

［15］Ali NA，McKay MJ，Molloy MP.Proteomics of Smad4 regulated transforming growth factor－beta signalling in colon cancer cells［J］.Mol Biosyst，2010，6（11）：2332－2338.

［16］Ghosh D，Yu H，Tan XF，et al.Identification of key players for colorectal cancer metastasis by iTRAQ quantitative proteomics profiling of isogenic SW480and SW620 cell lines［J］.J Proteome Res，2011，10（10）：4373－4387.

［17］Tong SW，Yang YX，Hu HD，et al.Proteomic investigation of 5－fluorouracil resistance in a human hepatocellular carcinoma cell line［J］.J Cell Biochem，2011，113（5）：1671－1680.

［18］Tan HT，Tan S，Lin Q，et al.Quantitative and temporal proteome analysis of butyrate－treated colorectal cancer cells［J］.Mol Cell Proteomics，2008，7（6）：1174－1185.

［19］Kilner J，Waby JS，Chowdry J，et al.A proteomic analysis of differential cellular responses to the short－chain fatty acids butyrate，valerate and propionate in colon epithelial cancer cells［J］.Mol Biosyst，2011，8（4）：1146－1156.

［20］Mallawaaratchy DM，Mactier S，Kaufman KL，et al.The phosphoinositide 3－kinase inhibitor LY294002，decreases aminoacyl－tRNA synthetases，chaperones and glycolytic enzymes in human HT－29colorectal cancer cells［J］.J Proteomics，2011，75（5）：1590－1599.