大鼠疼痛模型研究進(jìn)展＊

沈立姿，房立叢，于津鵬，朱曉鵬，胡遠(yuǎn)艷，長孫東亭 綜述，羅素蘭審校

（海南大學(xué)熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗室／海南大學(xué)?？谑泻Ｑ笏幬镏攸c(diǎn)實(shí)驗室，?？?70228）

疼痛是實(shí)際的或潛在的組織損傷所引起的一種不愉快的感覺也是一種預(yù)警機(jī)制，防止機(jī)體遭受壓迫或進(jìn)一步損傷。疼痛包括機(jī)體受到傷害性刺激后的痛感覺和所做出的痛反應(yīng)。按疼痛的發(fā)病機(jī)制，可分為生理性疼痛和病理性疼痛兩種，而后者又可分為炎性疼痛和神經(jīng)病理性疼痛。1994年，國際疼痛研究協(xié)會［1］（IASP）將之定義為“一種與組織損傷或潛在的與損傷相關(guān)的不愉快的主觀感覺和情感體驗”。

疼痛并不是單一的感覺，它有復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制［2－3］。雖然止痛藥可以緩解不同類型的疼痛，但它的作用機(jī)制是千差萬別的。因此，用單一的動物模型評價某種鎮(zhèn)痛藥藥效是不完善的。炎癥性痛是由于局部炎癥病灶內(nèi)鉀離子、氫離子的積聚和炎癥介質(zhì)的刺激引起的。神經(jīng)源性疼痛是由于疾病或外周、中樞神經(jīng)損傷引起的疼痛綜合征，是外周和中樞敏感化的結(jié)果。并且是臨床上常見的疼痛，其發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，治療效果不盡理想。有報道統(tǒng)計美國約有1%的人患神經(jīng)性疼痛，在當(dāng)今世界這是一個相當(dāng)可觀的數(shù)字，已引起科學(xué)家的注意。動物模型被廣泛地用于模仿各種疾病，并且用于研究各種臨床疾病的發(fā)病機(jī)制。盡管不同的動物模型都有其局限性，但如同臨床上疼痛的癥狀不完全相同，動物模型亦各有其特點(diǎn)，發(fā)生機(jī)制也不完全相同。本文將從物理刺激，化學(xué)刺激，神經(jīng)疼痛3個方面為大家介紹幾種大鼠疼痛模型及其研究進(jìn)展。

1 物理刺激法

物理刺激主要是指機(jī)械、熱、電等外界刺激引起機(jī)體產(chǎn)生一系列的反應(yīng)。痛覺過敏是指皮膚對機(jī)械刺激產(chǎn)生過度敏感的現(xiàn)象，也是神經(jīng)損傷后的一個特征重復(fù)性的傷害刺激可以導(dǎo)致持續(xù)性的疼痛，因此在實(shí)驗過程中可以通過測量疼痛的閾值來間接量化疼痛的程度，使疼痛程度變成一個直觀的數(shù)值。

1.1 大鼠機(jī)械痛覺測試 將實(shí)驗大鼠放置在有機(jī)玻璃觀察格中，觀察格則放在頂部有網(wǎng)眼的金屬架上，以方便von Frey測試。從而測定大鼠機(jī)械性縮足反射閾值（MWT）［4］。大鼠適應(yīng)環(huán)境半小時，待大鼠不再四處張望、探究，較安靜后，實(shí)驗者用von Frey測試探針緩慢地輕柔地刺激大鼠待測后肢足底中部，使探針彎曲，持續(xù)幾秒鐘觀察大鼠的縮足反應(yīng)，大鼠若由于刺激而出現(xiàn)快速的縮足反應(yīng)，則標(biāo)記為陽性反應(yīng)，若由于身體活動引起大鼠的縮足反應(yīng)則不算在內(nèi)。反復(fù)測量找到出現(xiàn)50%陽性反應(yīng)時的壓力值，這個值就是該只大鼠的MWT。Harry等［5］利用此方法確定了α－芋螺毒素可以明顯增高神經(jīng)結(jié)扎模型大鼠的機(jī)械痛閾值。α－芋螺毒素能選擇性抑制N型Ga2＋通道從而減輕特異性疼痛有望被開發(fā)成治療慢性疼痛的藥物。

1.2 大鼠熱痛覺測試 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)，室內(nèi)環(huán)境保持在25℃左右，將熱板儀的溫度設(shè)置在保持54℃左右。大鼠被放置在有密閉可拆卸的透明有機(jī)玻璃缸內(nèi)的熱板儀上記錄其出現(xiàn)舔后足或跳躍反應(yīng)的時間。Casarrubea等［6］確定此模型可用于鎮(zhèn)痛藥物的篩選也可用于增強(qiáng)學(xué)習(xí)能力，記憶能力等藥物的研究。筆者實(shí)驗室曾應(yīng)用此模型篩選出一些有鎮(zhèn)痛活性的芋螺毒素。

1.3 大鼠切口疼痛模型的建立 取清潔級SD大鼠麻醉，碘伏消毒大鼠一側(cè)后足，用手術(shù)刀在大鼠足底做一長約5mm的縱向切口，用鑷子夾起足底肌肉，并在切口左右縱向切割，動作輕柔保證其起止附著點(diǎn)的完整，用絲線縫合皮膚，并給予青霉素粉針，造模成功［7］。本模型制作簡單，傷害直觀，為術(shù)后鎮(zhèn)痛藥物的研究和開發(fā)提供了條件。Grzegorz等［8］通過實(shí)驗確定μO－芋螺毒素可以提高切口疼痛模型大鼠的機(jī)械痛閾值，并且不會阻礙傷口的愈合。Sylvia等［9］確定脊髓部位的γ氨基丁酸（GABA）可以調(diào)節(jié)本模型大鼠痛覺過敏。筆者對上述3種物理刺激模型簡單的進(jìn)行了比較，見表1。

2 化學(xué)刺激法

許多刺激性化學(xué)物質(zhì)接觸皮膚黏膜或注入體內(nèi)，均能引起炎性疼痛反應(yīng)，可用作疼痛模型的制作，可用以研究疼痛生理及篩選鎮(zhèn)痛藥物。

2.1 大鼠足底炎性疼痛模型的建立 實(shí)驗環(huán)境25℃，將大鼠放置在特制鼠籠里，大鼠右后足可伸出鼠籠，實(shí)驗者左手固定大鼠右后足。用1mL注射器抽取100μL的5%甲醛溶液注射到大鼠有后足足底皮下，制作甲醛疼痛模型。王靜捷等［10］酵母聚糖制作本模型，發(fā)現(xiàn)Zymosan表現(xiàn)出比Formalin更穩(wěn)定的，可靠地?zé)嵬从X過敏和機(jī)械痛覺過敏，并有明顯的水腫。Seungkyu等［11］通過實(shí)驗確定ω－芋螺毒素FVIA作用于N型Ca2＋通道，可以減少甲醛誘發(fā)的傷害性行為的累計時間，并且對與炎性疼痛和中樞致敏密切相關(guān)的第二時相更為有效。Yan等［12］也是利用本模型通過鞘內(nèi)給藥的方法確定ω－芋螺毒素SO－3也具有鎮(zhèn)痛作用，并且有劑量效應(yīng)。

甲醛誘導(dǎo)的炎性痛可表現(xiàn)為兩個時相，第一時相為皮下注射甲醛后立即表現(xiàn)出的疼痛行為，是由甲醛直接刺激神經(jīng)末梢所引起；第二時相為皮下注射甲醛約20min后發(fā)生的疼痛行為，是由于局部慢性炎癥導(dǎo)致的傷害性信息持續(xù)傳入引起的。大鼠在兩個時相所表現(xiàn)出的痛反應(yīng)是頻繁的舔注射足。兩個時相之間有一個10～15min的相對穩(wěn)定期，這一時間內(nèi)實(shí)驗大鼠很少表現(xiàn)傷害性反應(yīng)行為，較為安靜。

表1 物理刺激模型特點(diǎn)簡明比較

表2 化學(xué)刺激模型特點(diǎn)簡明比較

2.2 大鼠關(guān)節(jié)炎模型的建立 大鼠以40mg／kg水合氯醛麻醉，將0.1mL的完全弗氏佐劑（CFA）注射到大鼠后足跖皮下，約4h后可出現(xiàn)原發(fā)性病變，注射點(diǎn)附近出現(xiàn)紅腫。此現(xiàn)象可持續(xù)5d而7d后大鼠四肢的關(guān)節(jié)和腳掌部位會出現(xiàn)腫脹等繼發(fā)性病變。陸繼娣等通過實(shí)驗確定中藥熏蒸可以降低本模型大鼠血液和關(guān)節(jié)中的致炎因子白細(xì)胞介素的含量，并且存在劑量效應(yīng)。Ekberg等［13］確定出μΟ－型芋螺毒素 MrVIB選擇性阻斷感覺神經(jīng)元的Nav 1.8通道，對不引起運(yùn)動障礙的慢性疼痛有效，同時也可以提高本模型大鼠的痛閾值。Toru等［14］利用Zymosan成功制作了大鼠關(guān)節(jié)炎疼痛模型，并確定在關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射骨形成蛋白7（BMP－7），通過提高BMP－7的水平和減少白細(xì)胞介素1β（IL－1β）的水平，從而對炎癥性關(guān)節(jié)炎模型的軟骨退變起到保護(hù)作用。

2.3 偏頭痛大鼠模型的建立 取SD大鼠硝酸甘油注射劑，注射劑量按照15mg／kg進(jìn)行皮下注射，實(shí)驗大鼠2只耳朵紅腫，且不停的左右甩頭，用前肢抓撓頭部毛發(fā)，煩躁，來回走動，用頭部輕頂鼠籠，此現(xiàn)象持續(xù)2～3h后，大鼠安靜的趴窩在鼠籠中，活動明顯減少，模型制作成功。趙永烈等［15］通過本模型從組織學(xué)上確定芎芷地龍湯可以減少由硝酸甘油誘導(dǎo)的c－fos的表達(dá)，增加五羥色胺的表達(dá)，減少三叉神經(jīng)脊束核神經(jīng)細(xì)胞的興奮性，激活五羥色胺下行鎮(zhèn)痛系統(tǒng)，并且可持續(xù)較長時間，增高痛閾，阻止痛覺信息的傳遞，從而起到鎮(zhèn)痛作用。彭成等人檢測出在本模型大鼠的腦組織c－fos和c－jun基因表達(dá)異常。筆者對上述3種化學(xué)刺激模型簡單的進(jìn)行了比較，見表2。

3 神經(jīng)病理性痛模型

神經(jīng)源性疼痛是由于疾病或外周、中樞神經(jīng)損傷引起的疼痛綜合征，是外周和中樞敏感化的結(jié)果，其中脊髓敏感化起著十分重要的作用。機(jī)體的中樞或外周神經(jīng)組織損傷后神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生病理性改變，從而引起痛覺異常和痛覺過敏。

3.1 大鼠坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷型神經(jīng)病理痛模型（SNI）的建立 實(shí)驗室溫度保持在25℃，實(shí)驗大鼠采用腹腔給藥的方式進(jìn)行麻醉，大鼠俯臥置于手術(shù)臺上，右后腿剪毛，消毒，用手術(shù)剪剪開腿部皮膚［16］，逐層分離皮下脂肪、淺筋膜，雙手執(zhí)眼科鑷鈍性分離股二頭肌，使坐骨神經(jīng)主干暴露在視野內(nèi)，結(jié)扎并剪斷其分支脛神經(jīng)、腓總神經(jīng)，保留并避免損傷腓腸神經(jīng)，逐層縫合肌肉和皮膚，并在縫合前和縫合后在傷口處涂抹青霉素粉針劑，以防止手術(shù)后的感染。姜艷華等［17］利用本模型確定米諾環(huán)素可通過減少標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞（OX－42）的表達(dá)進(jìn)一步抑制脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，最終達(dá)到減輕痛覺超敏和痛覺過敏的現(xiàn)象，并確定米諾環(huán)素具有劑量效應(yīng)。Metz等［18］研究發(fā)現(xiàn)SNI模型大鼠的神經(jīng)元樹突比假手術(shù)大鼠的樹突更長，分支也更多。

3.2 大鼠坐骨神經(jīng)慢性擠壓傷病理性痛模型（CCI）的建立實(shí)驗室溫度保持在25℃，實(shí)驗大鼠采用腹腔給藥的方式進(jìn)行麻醉，大鼠俯臥置于手術(shù)臺上，右后腿剪毛，消毒，用手術(shù)剪剪開腿部皮膚，逐層分離皮下脂肪、淺筋膜，雙手執(zhí)眼科鑷鈍性分離股二頭肌，使坐骨神經(jīng)主干暴露在視野內(nèi)，用鑷子將坐骨神經(jīng)主干輕輕剝離，在坐骨神經(jīng)干上每間隔約1mm用3－0鉻制羊腸線做4個結(jié)扎，在結(jié)扎時保持力度一致，結(jié)扎強(qiáng)度以不完全阻斷血管為宜，結(jié)扎時可見肢體輕微抽動。逐層縫合肌肉和皮膚，并在縫合前和縫合后在傷口處涂抹青霉素粉針劑，以防止手術(shù)后的感染。在本模型的發(fā)展過程中，也有人用不同材料如羊腸線、絲線、PE套管等對大鼠坐骨神經(jīng)進(jìn)行擠壓，最終確定羊腸線和絲線經(jīng)生理鹽水浸泡后使用效果穩(wěn)定，并且羊腸線更適用于此模型的制備［19］。Narmatha等［20］通過不同的給藥部位確定α－芋螺毒素Vc 1.1可以提高大鼠的痛閾值。并且通過不同的給藥部位（手術(shù)側(cè)后肢，對側(cè)后肢）確定其對大鼠的受損神經(jīng)有修復(fù)作用。Richard等［21］認(rèn)為用未成年大鼠制作CCI模型機(jī)械痛更易誘發(fā)炎性痛，并與人類新生兒神經(jīng)損傷后的臨床表現(xiàn)一致，保障研究人員進(jìn)一步探索神經(jīng)痛的發(fā)病機(jī)制和治療方法。Joseph等［22］研究表明，ZZ－204G是一種作用于a9a10受體的小分子拮抗劑，是一種新型結(jié)構(gòu)的鎮(zhèn)痛劑。在治療慢性炎癥和神經(jīng)性疼痛方面有潛在的應(yīng)用前景。筆者實(shí)驗室就采用此模型對芋螺毒素的鎮(zhèn)痛活性進(jìn)行篩選，先建立大鼠的CCI模型，喂養(yǎng)1周后對合格大鼠做鞘內(nèi)置管作為中樞給藥的給藥途徑。

表3 神經(jīng)病理性疼痛模型特點(diǎn)比較

3.3 大鼠脊神經(jīng)結(jié)扎模型的（SNL）建立 實(shí)驗人員將大鼠麻醉，讓其俯臥在手術(shù)臺上，大鼠背部褪毛消毒，將腰部位置墊高，左手用鑷子拉起大鼠L5－L6脊椎間的皮膚，右手用手術(shù)剪將其剪開，作一皮膚縱切口，鈍性分離皮下的肌肉，使L5－L6關(guān)節(jié)突暴露在手術(shù)視野內(nèi)，無菌條件下切除關(guān)節(jié)突，輕輕地分離L5－L6脊神經(jīng)，用絲線結(jié)扎L6的背根神經(jīng)節(jié)，逐層縫合肌肉和皮膚，并在縫合前和縫合后在傷口處涂抹青霉素粉針劑，以防止手術(shù)后的感染。Aldric等［23］通過實(shí)驗確定芋螺毒素MVⅡA和con－G可以明顯提高脊神經(jīng)結(jié)扎模型大鼠的痛閾值，con－G降低周圍神經(jīng)痛的效果要強(qiáng)于甲醛模型的疼痛。

3.4 大鼠骨癌疼痛模型的建立 Medhurst等［24］將乳腺腫瘤細(xì)胞在培養(yǎng)基上擴(kuò)大培養(yǎng)，用胰蛋白酶溶液降解，離心，用平衡鹽溶液洗滌沉淀，在離心洗滌2次，最后腫瘤細(xì)胞會懸浮于鹽溶液中，備用。大鼠麻醉后，在脛骨上段開一小口，先在脛骨干骺端穿刺打孔，再注入腫瘤細(xì)胞混懸液，用醫(yī)用骨蠟封堵針孔，建立大鼠脛骨骨癌模型。有些研究者曾用前列腺腫瘤細(xì)胞成功制作大鼠骨癌疼痛模型，并確定腫瘤可以激活脊髓神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞釋放IL－1β和其他物質(zhì)使痛覺過敏［25］。Anton等［26］確定作用于N－型電壓敏感性鈣離子通道的ω－芋螺毒素來考諾太與嗎啡合用對骨癌疼痛模型大鼠有協(xié)同鎮(zhèn)痛作用。Wala等［27］的研究表明，ZZ1－61c是作用于a9a10膽堿受體，有獨(dú)特拮抗作用的新型化合物，對預(yù)防和減弱化療導(dǎo)致的神經(jīng)性疼痛有潛在的研究價值，因此它為避免膽堿受體激動劑的毒性提供了有效的治療方法。筆者對上述4種神經(jīng)病理性痛模型簡單的進(jìn)行了比較，見表3。

4 討 論

疼痛是機(jī)體受到損害后一種保護(hù)性反應(yīng)，也是某些疾病的一種癥狀，可使人感到痛苦。某些長期劇烈的疼痛對機(jī)體已成為一種難以忍受的折磨，使人們生活質(zhì)量下降，對工作生活不利，這引起了科研人員的廣泛關(guān)注。鎮(zhèn)痛藥物的研究是目前醫(yī)學(xué)中最活躍的領(lǐng)域之一，由于疼痛的發(fā)病機(jī)制不同，因此各種疼痛模型的制備顯得尤為重要。目前，筆者實(shí)驗室正在選用上述模型，對被譽(yù)為“海洋藥物寶庫”的海南產(chǎn)芋螺毒素進(jìn)行鎮(zhèn)痛活性篩選，和藥效評價，已篩選到鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)大、作用靶點(diǎn)清楚、無成癮性的新型芋螺毒素先導(dǎo)藥物，為下一步原創(chuàng)新型鎮(zhèn)痛藥物的研發(fā)奠定了堅實(shí)的基礎(chǔ)。

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